結(jié)核病免疫機(jī)制及疫苗研究進(jìn)展

達(dá)澤蛟，祝秉東，張穎

1. 蘭州大學(xué)結(jié)核病研究中心暨病原生物學(xué)研究所，蘭州 730000; 2. 美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)布隆博格公共衛(wèi)生學(xué)院分子微生物學(xué)與免疫學(xué)系，馬里蘭州 21205

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)是一種頑固的病原體，已感染全世界1/3人口。每年有約900萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，近200萬(wàn)例死于結(jié)核病[1]。隨著越來(lái)越多耐藥菌株的出現(xiàn)，特別是耐多藥(至少對(duì)2種一線抗結(jié)核藥物異煙肼和利福平耐藥)和廣泛耐藥(在耐多藥的基礎(chǔ)上，又對(duì)2種主要的二線抗結(jié)核藥物氨基糖苷類(lèi)和氟喹諾酮類(lèi)藥物耐藥)菌株的出現(xiàn)，給結(jié)核病的控制帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)[2]。由于人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響(如部分地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展落后、個(gè)體營(yíng)養(yǎng)狀況差)、精神及軀體壓力等因素，宿主免疫力低下，最終使處于潛伏期的結(jié)核分枝桿菌活化或?qū)е虏糠謧€(gè)體再感染[3]。這使得當(dāng)前結(jié)核病疫情愈加嚴(yán)峻。

目前，結(jié)核病疫情與其化療藥物和卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)的有效性形成矛盾。導(dǎo)致該結(jié)果的主要因素包括：結(jié)核病需要長(zhǎng)期服藥和結(jié)核分枝桿菌耐藥，特別是結(jié)核病控制策略沒(méi)有充分考慮到結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染。BCG不能提供有效的免疫保護(hù)力來(lái)抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染，尤其不會(huì)對(duì)處于潛伏期的結(jié)核病患者產(chǎn)生任何效果。每年900萬(wàn)的新發(fā)結(jié)核病例，在某種程度上反映了這個(gè)問(wèn)題。結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染就像一顆定時(shí)炸彈，已成為結(jié)核病防治的一大隱患。當(dāng)機(jī)體免疫力低下時(shí)(如HIV感染、麻疹、營(yíng)養(yǎng)不良、情緒低落等)，潛伏的結(jié)核分枝桿菌感染就可能轉(zhuǎn)化為活動(dòng)性結(jié)核病[4]。因此，對(duì)于結(jié)核病防治，必須兼顧針對(duì)活動(dòng)期和潛伏期的結(jié)核分枝桿菌感染。本文將圍繞結(jié)核病免疫發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展，討論如何將其用于新疫苗研制，同時(shí)對(duì)當(dāng)前新疫苗研發(fā)的進(jìn)展作一綜述。

1 結(jié)核病免疫機(jī)制

當(dāng)人吸入結(jié)核分枝桿菌后，30%個(gè)體會(huì)被感染。感染個(gè)體中，90%處于潛伏期，不到10%發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核。處于潛伏感染期的個(gè)體，一生中有不到10%的概率發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。導(dǎo)致以上變化發(fā)生的危險(xiǎn)因素包括宿主的易感性、社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展落后、年老及其他原因?qū)е碌拿庖吡Φ拖?。如HIV感染者發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的概率每年>10%[5]。

結(jié)核分枝桿菌經(jīng)呼吸道引起肺部感染，在機(jī)體建立免疫力前被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬，并在其中增殖。機(jī)體在抗結(jié)核免疫反應(yīng)作用下，細(xì)胞及組織病理?yè)p傷表現(xiàn)為典型的干酪樣壞死，參與的各種免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并構(gòu)成結(jié)核肉芽腫。在機(jī)體免疫反應(yīng)作用下，結(jié)核分枝桿菌停止增殖，病理?yè)p傷有所局限。但不是所有結(jié)核分枝桿菌都被殺死，在機(jī)體免疫力低下時(shí)又會(huì)增殖。干酪樣損傷進(jìn)一步液化，流入血管引起血行播散，形成粟粒型肺結(jié)核和肺外結(jié)核(如結(jié)核性腦膜炎)。病灶液化可侵入氣道形成結(jié)核空洞，大量結(jié)核分枝桿菌在空洞增殖、生長(zhǎng)，并通過(guò)呼吸道進(jìn)行傳播[6]。

結(jié)核分枝桿菌通過(guò)補(bǔ)體受體3(complement receptor 3，CR3)[7]、甘露糖受體(mannose receptor，MR)和清道夫受體(scavenger receptor，SR)[8]被巨噬細(xì)胞吞噬，形成吞噬體(圖1)。吞噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，溶酶體中的酶再降解結(jié)核分枝桿菌的蛋白及其他成分，該過(guò)程稱(chēng)為自噬，是天然免疫的一部分。但結(jié)核分枝桿菌通過(guò)分泌酸性磷酸酶(secreted acid phosphatase，SapM)[9]、蛋白激酶G(protein kinase G，PKG)[10]和糖基化磷脂酰肌醇等來(lái)抑制吞噬體與溶酶體的融合[11]。SapM是一種分泌型類(lèi)脂磷酸酶，能水解磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate，PI3P)。PI3P是位于吞噬體膜表面的一種運(yùn)輸調(diào)節(jié)脂類(lèi)，為吞噬體與溶酶體融合所必需[9]。吞噬體中的結(jié)核分枝桿菌清除PI3P，能阻止吞噬體與溶酶體的融合。另外，結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁成分脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)可模仿哺乳動(dòng)物磷脂酰肌醇阻止磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)及其產(chǎn)物PI3P，從而抑制吞噬體發(fā)展為吞噬溶酶體，使結(jié)核分枝桿菌存活[11,12]。PKG類(lèi)似于真核細(xì)胞的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase，Akt)，與抑制吞噬體與溶酶體融合有關(guān)[10]，但確切機(jī)制及其宿主靶位還不清楚。最近研究表明，T輔助細(xì)胞1型(T helper cell type 1，Th1)相關(guān)細(xì)胞因子——γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)能促進(jìn)吞噬體與溶酶體融合，并通過(guò)干擾素誘導(dǎo)蛋白1(interferon-inducible Golgi membrane associated GTPase，Irgm1/LRG-47)[13,14]和PI3K[15]細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用。然而Th2相關(guān)細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素4(interleukin 4，IL-4)和IL-13可通過(guò)Akt信號(hào)途徑終止自噬功能和自噬介導(dǎo)的殺菌作用。此外，IL-4和IL-13通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)轉(zhuǎn)錄因子抑制IFN-γ誘發(fā)的自噬作用[16]。除吞噬作用相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)核分枝桿菌19kD脂蛋白、脂化甘露聚糖、磷脂酰肌醇甘露糖苷和核酸與巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、TLR4、TLR9等模式識(shí)別受體相互作用，通過(guò)髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)、IL-1 I型受體相關(guān)蛋白激酶激活TLR介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)活化入核，促進(jìn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-12表達(dá)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等生成增多[17]。此外，TLR2活化激活巨噬細(xì)胞維生素D受體和維生素D-1-羥化酶基因，最終分泌抗菌肽以殺死細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌[18]。

圖1 結(jié)核分枝桿菌與宿主細(xì)胞在巨噬細(xì)胞水平的相互作用

Fig.1Mycobacteriumtuberculosis-host cell interaction at macrophage level

感染的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子，包括IL-12、IL-23、IL-7、IL-15、TNF，并呈遞各種抗原給CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD1限制性T細(xì)胞(識(shí)別脂質(zhì)抗原)和γδT細(xì)胞(圖2)[19]?；罨腡細(xì)胞分泌IFN-γ，與TNF共同激活巨噬細(xì)胞，通過(guò)活性氮、活性氧介導(dǎo)，殺死胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌。另外，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞分泌顆粒溶素、穿孔素，殺死胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌。但CD4+Th2產(chǎn)生的IL-4和CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)產(chǎn)生的IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)抑制IFN-γ介導(dǎo)的殺結(jié)核分枝桿菌作用[20-22]，有效下調(diào)炎癥反應(yīng)，從而有助于結(jié)核分枝桿菌生存。另有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌甘露糖末端修飾的LAM可刺激Treg分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β[23]。近幾年來(lái)，對(duì)以分泌IL-17為特征的新T細(xì)胞亞群Th17的研究表明，Th17是重要的炎癥反應(yīng)和CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)者[24]。Th17分泌IL-17并募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ，刺激趨化因子表達(dá)[24]。但I(xiàn)FN-γ亦能抑制Th17分泌IL-17，有利于限制結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷(圖2)[25]。雖然近幾年免疫學(xué)發(fā)展迅速，但目前對(duì)干酪樣壞死及液化的機(jī)制仍不清楚。

圖2 結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)

Fig.2 Cellular immune response toMycobacteriumtuberculosisinfection

2 BCG存在的問(wèn)題

BCG是Calmette和Guérin將牛型結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過(guò)230次傳代培養(yǎng)，歷時(shí)13年(1908～1921年)所研制的減毒分枝桿菌。BCG是目前應(yīng)用最廣泛的結(jié)核分枝桿菌疫苗，已接種76%新生兒。它能降低小兒患嚴(yán)重結(jié)核性腦膜炎及粟粒型肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)70%～80%的新生兒；但其保護(hù)效應(yīng)不穩(wěn)定，尤其對(duì)患肺結(jié)核的成人保護(hù)力較差。如在南印度Chingleput地區(qū)，BCG的保護(hù)率為0%；而在英國(guó)學(xué)齡兒童中保護(hù)率可高達(dá)80%[26,27]。盡管BCG得到廣泛應(yīng)用，但面對(duì)全球結(jié)核病疫情的蔓延卻無(wú)能為力。因?yàn)樽鳛橐环N預(yù)防性疫苗，它不能有效治療結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染。此外，由于BCG仍存在一定毒力，免疫力低下的兒童(多為先天性免疫缺陷)接種BCG后可引起結(jié)核病樣的BCG疾病(經(jīng)血行及淋巴播散全身)。

BCG缺乏有效性的確切原因還不清楚，可能與以下因素有關(guān)[27]：BCG菌株多樣，不同菌株的免疫原性可導(dǎo)致不同的保護(hù)效應(yīng)；BCG菌株可能在反復(fù)的體外培養(yǎng)中丟失了一些重要的抗原；也可能與宿主的遺傳因素有關(guān)；環(huán)境分枝桿菌的感染可能掩蓋BCG的保護(hù)力；最近研究顯示BCG與臨床致病結(jié)核分枝桿菌有很大不同，如BCG對(duì)流行的臨床菌株北京株缺乏有效作用[28]；還可能與寄生蟲(chóng)感染增強(qiáng)Th2反應(yīng)和Treg減弱BCG的保護(hù)效應(yīng)有關(guān)[29]。

3 新疫苗

由于現(xiàn)有的BCG存在很多問(wèn)題，因此尋找新的疫苗尤為重要[19,26,30,31]?？偟膩?lái)說(shuō)，處于現(xiàn)研究階段的疫苗可分為3類(lèi)：暴露前疫苗(預(yù)防為主)、暴露后疫苗(針對(duì)潛伏感染活化)和治療性疫苗(可提高化療的療效，增強(qiáng)殺菌效果)。

當(dāng)前候選疫苗也可分為BCG替代疫苗和亞單位疫苗[19,26]。BCG替代疫苗包括表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85和38kD的重組BCG，重組李斯特菌溶素(listeriolysin)[32]或產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素(perfringolysin)(http://www.aeras.org)的BCG，以及減毒活疫苗(結(jié)核分枝桿菌leuD、panCD、lysA、RD-1、phoP和mce2/3的突變體)[33-35]。亞單位疫苗包括蛋白疫苗(使用新型佐劑的融合蛋白Mtb72f、Ag85-ESAT6、Ag85-TB10.4)、表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原(如Ag85A)的病毒載體疫苗(痘病毒和腺病毒)[36,37]和DNA疫苗(HSP60、Ag85)[26,38]。表1列出了一系列處于不同研發(fā)階段的結(jié)核候選疫苗。其中進(jìn)展最快的為MVA85A(表達(dá)Ag85A的Ankara改良痘苗病毒)，用于強(qiáng)化BCG免疫，已進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)[39]。早期分泌抗原靶蛋白6(early secretory antigenic target 6，ESAT6)已作為診斷抗原，用以區(qū)別BCG免疫和結(jié)核分枝桿菌感染。因此，在各種研發(fā)的疫苗中，含有ESAT6的候選疫苗可能給結(jié)核病的診斷帶來(lái)困難[40]。

表1 處于不同研發(fā)階段的主要候選疫苗

Tab.1 Current tuberculosis vaccine candidates

Vaccine candidateDeveloperStageDescriptionAeras 422AerasClinical ⅠOverexpression of selected antigens and endosome escape to enhance antigen immunogenicityBCG::RD1Institut PasteurPreclinicalRecombinant BCG with reintroduction of RD1 and expressing antigens ESAT6 and CFP10rBCG::ΔureC-hlyMax Planck InstituteClinical ⅠUrease-deleted recombinant BCG expressing listeri-olysin from Listeria monocytogenesAttenuated MtbAlbert Einstein College of MedicinePreclinicalMtb with double deletion of lysA/panCD and RD-1/panCD Mtb ΔphoPInstitut PasteurPreclinicalMtb with inactivation of phoP by inserting a drug-resistance geneMVA85AOxford UniversityClinicalⅡA recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) containing Mtb antigen 85AAeras 402 / Crucell Ad35Crucell N.V./AerasClinicalⅡA replication-deficient adenovirus Ad35 containing Mtb antigens 85A, 85B, and TB10.4Mtb72FAeras/GlaxoSmithKlineClinicalⅡA fusion protein of Rv1196 and Rv0125 in adjuvant AS01 or AS02H1-CAF01Statens Serum Institut Clinical ⅠA fusion protein of 85B and ESAT6 in adjuvant CAF01H1-IC31Statens Serum Institut Clinical ⅠA fusion protein of 85B and ESAT6 in adjuvant IC31SSI/SP H4-IC31Statens Serum Institut /AerasClinical ⅠA fusion protein of 85B and TB10.4 in adjuvant IC31

Mtb,Mycobacteriumtuberculosis.

目前，BCG和重組BCG初次免疫后再用亞單位疫苗加強(qiáng)免疫的免疫策略被人們所接受[19,26,36]。巴西的研究表明[41]，反復(fù)接種BCG不能增強(qiáng)BCG的保護(hù)效果，即增加接種BCG次數(shù)也不能提高疫苗本身的效果。

4 疫苗佐劑

各型疫苗的研發(fā)主要集中在抗原篩選方面，但僅考慮抗原是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因?yàn)閱蝹€(gè)抗原所引起的免疫效應(yīng)有限，需合適的佐劑提高其免疫效應(yīng)和保護(hù)力。因此，新一代結(jié)核蛋白亞單位疫苗需要尋找一個(gè)理想的佐劑。70多年來(lái)，鋁佐劑是唯一一個(gè)在世界范圍廣泛應(yīng)用的注冊(cè)佐劑。另外，MF59在一些國(guó)家作為預(yù)防流行性感冒(簡(jiǎn)稱(chēng)流感)和甲型肝炎疫苗的佐劑，已經(jīng)注冊(cè)[42,43]。但以上2種佐劑主要介導(dǎo)體液免疫，對(duì)以細(xì)胞免疫為主的結(jié)核疫苗效果不佳。結(jié)核分枝桿菌與HIV的合并感染已成為世界公共衛(wèi)生問(wèn)題，這2種疾病都以細(xì)胞免疫為特點(diǎn)，但現(xiàn)有疫苗缺乏理想的針對(duì)細(xì)胞免疫為主的佐劑。

近幾年來(lái)，隨著佐劑技術(shù)的發(fā)展，一系列能誘導(dǎo)較強(qiáng)細(xì)胞免疫的佐劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。如Ag85B-TB10.4、Ag85B-ESAT6和Mtb72F融合蛋白分別在一種陽(yáng)離子多肽﹝KLKL5KLK與寡脫氧核苷構(gòu)成的佐劑(IC31)和由單磷酰脂A和皂角苷QS-21構(gòu)成的水-油乳濁液(AS02A) ﹞介導(dǎo)下，可誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并具有免疫保護(hù)效應(yīng)[44,45]。由陽(yáng)離子脂質(zhì)體二甲基三十六烷基銨(dimo-thylidioctyl ammonium bromide，DDA)和trehalose 6,6-dibehenate (TDB)構(gòu)成一種新型的復(fù)合佐劑CAF01，可輔助結(jié)核融合蛋白Ag85B-ESAT6誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫效應(yīng)。TDB為結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁索狀因子(cord factor)類(lèi)似合成物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示其保護(hù)效果較理想，已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)[46]。從以上不難看出佐劑發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)，即單個(gè)成分的佐劑可能被復(fù)合佐劑所取代。單個(gè)佐劑的免疫效應(yīng)有限，且不同佐劑之間各有特點(diǎn)，所以合理搭配不同的佐劑已成為研發(fā)新型佐劑的趨勢(shì)。一些新技術(shù)的應(yīng)用(如納米技術(shù))也推動(dòng)了佐劑發(fā)展，如以聚乳酸-羥基乙酸共聚物﹝poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA﹞為載體的佐劑聯(lián)合融合蛋白TB10.4-Ag85B，能增強(qiáng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)[47]。

雖然佐劑技術(shù)有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但尋找一個(gè)安全、穩(wěn)定和有效的佐劑，仍需要大量的研究和時(shí)間檢驗(yàn)。

5 疫苗評(píng)價(jià)

抗結(jié)核疫苗的保護(hù)效率通常以免疫原性、結(jié)核菌載量(bacterial load)和感染動(dòng)物的生存時(shí)間來(lái)評(píng)價(jià)[19,26]。免疫原性的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)包括與保護(hù)相關(guān)的細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-2和TNF-α)分泌量和活化的T細(xì)胞數(shù)目(CD4+和CD8+T細(xì)胞)。評(píng)價(jià)結(jié)核疫苗的保護(hù)效率是一項(xiàng)十分復(fù)雜的工作，牽涉諸多因素，包括不同的動(dòng)物模型(小鼠、豚鼠、兔和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)，不同的免疫途徑(皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、氣溶膠和口腔)，不同的劑量(低、中、高)，不同的間隔時(shí)間和加強(qiáng)次數(shù)(4周、6周、8周)，不同的毒力菌株(Erdman、H37Rv、臨床株)，不同的毒株攻擊劑量(低、中、高)，不同的感染途徑(氣溶膠、靜脈)，從感染到檢測(cè)時(shí)間間隔(4周、6周、8周)和不同的判斷標(biāo)準(zhǔn)(動(dòng)物生存狀況、菌落形成單位、病理學(xué)和脾臟重量)。

在人體評(píng)價(jià)疫苗的免疫原性更復(fù)雜，因?yàn)槟鼙Ｗo(hù)人體有關(guān)的免疫參數(shù)還未徹底搞清楚。不過(guò)，新方法的建立給疫苗篩選帶來(lái)了啟發(fā)。如從已注射疫苗動(dòng)物體內(nèi)分離T細(xì)胞，與巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外結(jié)核分枝桿菌抑制檢測(cè)。最近Ⅱ期臨床試驗(yàn)表明，BCG初次免疫后用MVA85A強(qiáng)化可誘導(dǎo)較高的細(xì)胞免疫反應(yīng)， IFN-γ和TNF-α分泌增多，并誘導(dǎo)可分泌IL-2的記憶性T細(xì)胞[39]，但其保護(hù)效果仍有待觀察。然而，南非的研究發(fā)現(xiàn)，新生兒接種BCG 2年后，CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平與免疫保護(hù)效果并不相關(guān)[48]。

新疫苗的臨床試驗(yàn)花費(fèi)巨大，耗時(shí)較長(zhǎng)，在整個(gè)臨床試驗(yàn)階段，評(píng)價(jià)體系又不夠精確，因此新疫苗的臨床前研究至關(guān)重要。如果能在實(shí)驗(yàn)室盡可能系統(tǒng)地評(píng)價(jià)出理想的新疫苗，就有可能避免臨床試驗(yàn)時(shí)不必要的浪費(fèi)，節(jié)省大量的資金和時(shí)間。合適的動(dòng)物模型是首先要考慮的問(wèn)題。不同動(dòng)物對(duì)結(jié)核分枝桿菌的敏感性不同，不同動(dòng)物針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫特點(diǎn)也不同(如小鼠感染結(jié)核分枝桿菌后可誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞免疫，但不能形成典型的干酪樣壞死病變，而豚鼠恰好相反)。因此，長(zhǎng)期以來(lái)作為結(jié)核免疫研究對(duì)象的兔模型，已得到很多學(xué)者的重視。有研究表明，兔模型在篩選疫苗方面可能有更好的優(yōu)勢(shì)。為避免不同動(dòng)物模型的局限性，盡可能選擇多個(gè)動(dòng)物模型，最后綜合評(píng)價(jià)，也許是不錯(cuò)的辦法[49]。

目前，許多實(shí)驗(yàn)室都選擇H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株作為毒力攻擊株，這也存在很大的局限性，或許應(yīng)該選擇一些臨床菌株如北京株。最好在進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，選擇當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行毒力攻擊實(shí)驗(yàn)，這可能更有臨床意義[50]。

6 合理的疫苗研發(fā)策略

長(zhǎng)期以來(lái)，人們普遍認(rèn)為T(mén)h1型細(xì)胞因子IFN-γ能保護(hù)機(jī)體抵抗結(jié)核病，但過(guò)強(qiáng)的Th1型免疫反應(yīng)會(huì)引起組織病理?yè)p傷。Th2反應(yīng)和Treg抑制Th1反應(yīng)能阻止組織損傷，但會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌存活[16,22]。如何在兩者之間找到平衡，在保護(hù)組織、局限組織損傷的同時(shí)，也能限制甚至殺死結(jié)核分枝桿菌，是理想疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-13對(duì)抗IFN-γ介導(dǎo)的免疫保護(hù)，減少TNF介導(dǎo)的感染細(xì)胞的凋亡和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活動(dòng)，增強(qiáng)Treg作用，提高TNF的毒性，故會(huì)減弱抗菌作用[22]。疫苗可能不僅需提高CD4的Th1反應(yīng)，還要減弱Th2(IL-4)和Treg反應(yīng)(IL-10、TGF- β)[22]。最近研究表明，重復(fù)接種可刺激Th1反應(yīng)的候選疫苗可能導(dǎo)致隨后向Th2反應(yīng)發(fā)展。如有保護(hù)效果的Ag85B DNA疫苗經(jīng)蛋白Ag85B加強(qiáng)后，免疫保護(hù)效果丟失。這可能是由于經(jīng)過(guò)強(qiáng)化免疫后，免疫反應(yīng)向Th2方向發(fā)展[51]。Ag85A DNA疫苗初次免疫能增強(qiáng)BCG的保護(hù)效果，但BCG免疫后用Ag85A的DNA、85A蛋白或MVA85A強(qiáng)化免疫不能增強(qiáng)BCG的保護(hù)力，相反可引起與病理相關(guān)的IL-17分泌[52]。

候選疫苗(rBCG::△ureC-hly、DNA疫苗、表達(dá)結(jié)核分枝桿菌抗原的病毒載體)刺激CD8+T細(xì)胞，能提供有效的保護(hù)力，抵抗肺結(jié)核的發(fā)生[32,37,38,53]。德國(guó)馬普研究所依據(jù)宿主與病原體之間的免疫反應(yīng)，設(shè)計(jì)了重組BCG(rBCG::△ureC-hly)，從BCG剔除了尿素酶基因以防尿素酶堿化吞噬小體空泡，而酸化空泡可利于吞噬小體與溶酶體的融合。此外，該BCG變異株表達(dá)來(lái)自于李斯特菌的溶菌素基因，導(dǎo)致吞噬小體溶解，更有效地通過(guò)主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類(lèi)分子呈遞抗原給CD8+T細(xì)胞。同時(shí)，使已感染的巨噬細(xì)胞凋亡，樹(shù)突細(xì)胞攝取其裂解物，反過(guò)來(lái)進(jìn)行更有效的抗原呈遞，整個(gè)過(guò)程稱(chēng)交叉致敏[32]。人們依據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌溶素研制了一個(gè)類(lèi)似的疫苗。

新型佐劑IC31已用于重組結(jié)核分枝桿菌Ag85B和TB10.4蛋白，可有效刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞[44]。此外，佐劑AS02與蛋白亞單位疫苗Mtb72F能誘導(dǎo)Th1免疫反應(yīng)(表1)[45]。

BCG缺乏RD1區(qū)域，已表明將該區(qū)域基因互補(bǔ)入BCG能提高其保護(hù)力[54]，但是否會(huì)增強(qiáng)BCG的毒力還有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。PhoP是結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)重要毒力致病因子，結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra株毒力降低與phoP基因突變密切相關(guān)。phoP突變株亦可能是一個(gè)有希望的候選疫苗[34]。最近，H37Ra基因組測(cè)序已經(jīng)完成[55]，有可能以H37Ra株為參照研制出新的減毒活疫苗。

利用處于休眠期的蛋白研制針對(duì)潛伏感染的疫苗，引起了人們的濃厚興趣。人們?cè)O(shè)計(jì)了表達(dá)休眠相關(guān)基因如DosR調(diào)節(jié)蛋白的重組BCG(表1)[56]或基于DosR蛋白設(shè)計(jì)亞單位疫苗[57,58]。最近有研究報(bào)道，將結(jié)核分枝桿菌休眠期抗原Rv2660c和Ag85B、ESAT6融合制備的疫苗既具有預(yù)防性疫苗的作用，還可有效預(yù)防潛伏感染結(jié)核分枝桿菌的復(fù)活[59]。

7 結(jié)核病疫苗發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)

結(jié)核病疫苗的發(fā)展面臨諸多挑戰(zhàn)，如缺乏預(yù)測(cè)臨床保護(hù)效果的替代指標(biāo)，這將是疫苗研發(fā)的巨大障礙。Ⅲ期臨床試驗(yàn)需花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間(3～4年，甚至更長(zhǎng))和大量患者，試驗(yàn)成本昂貴。更重要的是，缺乏臨床試驗(yàn)場(chǎng)所。不過(guò)，最近Aeras全球結(jié)核病疫苗基金會(huì)正在印度、南非、肯尼亞和烏干達(dá)等地建立試驗(yàn)場(chǎng)地(http://www.aeras.org)，包括歐洲和發(fā)展中國(guó)家的合伙人也正在增建臨床試驗(yàn)場(chǎng)地，這些將為結(jié)核疫苗的最終應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

8 展望

在結(jié)核疫苗的發(fā)展研制過(guò)程中，出現(xiàn)了很多有趣的問(wèn)題。許多候選疫苗正在進(jìn)行臨床前研究，有幾種已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅰ期或Ⅱ期試驗(yàn)研究。Aeras全球結(jié)核病疫苗基金會(huì)受比爾·蓋茨及梅林達(dá)·蓋茨基金會(huì)資助，將在肺結(jié)核病防治中發(fā)揮重要作用，有望在未來(lái)幾年內(nèi)開(kāi)發(fā)出能控制結(jié)核病疫情的新疫苗 (http://www.aeras.org)。但依然有很多不確定的因素，如動(dòng)物研究中有效的候選疫苗在人體是否同樣有效？所以，有必要進(jìn)一步探索與人體保護(hù)效果有關(guān)的人體免疫參數(shù)或生物標(biāo)記，然后用多參數(shù)分析復(fù)雜的免疫系統(tǒng)。對(duì)比分析結(jié)核病患者和純化蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)陽(yáng)性健康對(duì)照的免疫反應(yīng)，同時(shí)動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)處于潛伏期感染的個(gè)體免疫參數(shù)，尤其是發(fā)展為結(jié)核病和最終未發(fā)展為結(jié)核病的個(gè)體參數(shù)，可揭示免疫系統(tǒng)(包括固有免疫和獲得性免疫)抗結(jié)核及控制潛伏感染的機(jī)制。這將使人們不僅更深入了解宿主針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫保護(hù)反應(yīng)，還有助于研發(fā)更有效的疫苗。為能更好地控制結(jié)核病，不僅需要快速診斷和較短時(shí)間的化療，更重要的是需要一種優(yōu)于BCG或可強(qiáng)化BCG的疫苗即接觸前疫苗，還需要針對(duì)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的治療性疫苗。

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