HPLC法同時測定黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量Δ

張偉，于海林，宋艷麗，康文藝#

（1.黃河科技學院，鄭州市 450063；2河南大學中藥研究所，開封市 475004）

HPLC法同時測定黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量Δ

張偉1，2＊，于海林2，宋艷麗2，康文藝2#

（1.黃河科技學院，鄭州市 450063；2河南大學中藥研究所，開封市 475004）

目的：建立同時測定黃海棠中山柰酚和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液（60∶40），流速為1.0mL·min-1，柱溫為25℃，檢測波長為370nm。結果：山柰酚、槲皮素進樣量的線性范圍分別為0.0184～0.1288μg（r＝0.9998）、0.008～0.064μg（r＝0.9999）；二者的平均加樣回收率分別為97.12%（RSD＝1.03%，n＝6）、96.51%（RSD＝1.32%，n＝6）。結論：本方法靈敏、準確、重復性好，可用于黃海棠的質量控制。

黃海棠；高效液相色譜法；山柰酚；槲皮素；含量測定

藤黃科金絲桃屬植物黃海棠（Hypericum ascyronL.）又名紅旱蓮、湖南連翹等，為多年生草本植物，分布于我國東北地區(qū)及黃河、長江和珠江流域。民間將其廣泛用于止痛、抗菌消炎、治療創(chuàng)傷等[1]。黃海棠的化學成分和藥理研究不是很多，已有的研究證明其有良好的抗炎鎮(zhèn)痛效果[2]；從中分離得到了黃酮、口山酮和間苯三酚衍生物等化合物[3～7]。山柰酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）為黃海棠中黃酮類主要成分，具有降壓、降血脂及抗腫瘤等作用[8～11]。有研究用分光光度法對黃海棠總黃酮含量進行了測定[12]，該方法操作復雜且只能測定總黃酮含量。筆者在對該植物系統化學和藥理作用的研究中，首次采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定了黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量，可為評價該藥材質量及合理用藥提供依據。

1 儀器與試藥

LC-2010A型HPLC儀，包括CLAS-VP色譜工作站、UV-2010A檢測器、自動進樣器、柱溫箱、四元低壓梯度泵（日本島津公司）；KQ-500DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純；山柰酚、槲皮素標準品（河南大學中藥研究所自制，質量分數：98%）；黃海棠全草于2006年6月采集于河南省欒川縣，由河南大學中藥研究所生藥教研室李昌勤副教授鑒定為藤黃科植物黃海棠H.ascyronL.，標本存放于河南大學中藥研究所（No.06070103）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液（60∶40）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃；檢測波長：370nm；進樣量：10μL。在此條件下，槲皮素、山柰酚與其他成分的分離度R＞1.5，保留時間適中，理論板數按山柰酚峰計算應不低于3000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.山柰酚標準品；B.槲皮素標準品；C.黃海棠；1.山柰酚；2.槲皮素Fig1 HPLC chromatogramsA.kaempferide control；B.quercetin control；C.H.ascyron；1.kaempfeide；2.quercetin

2.2 混合標準品溶液的制備

精密稱取山柰酚標準品2.3mg和槲皮素標準品1.0mg，加甲醇制成每1mL含山柰酚0.0092mg和槲皮素0.0040mg的混合標準品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將干燥的黃海棠全草粉碎，過60目篩，精密稱取粉末40.0mg，置10mL容量瓶中，精密加入50%甲醇水溶液8mL，靜置12h，超聲（功率：500W，頻率：80kHz）提取 20min，放冷，定容至10mL，搖勻，以微孔濾膜（0.45μm）過濾，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取槲皮素和山柰酚混合標準品溶液適量，注入液相色譜儀，測定峰面積。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，制備標準曲線，得山柰酚的回歸方程為Y＝3×106X－1498.2（r＝0.9998），進樣量的線性范圍為0.0184～0.1288μg；槲皮素的回歸方程為Y＝4×106X－199.3（r＝0.9999），進樣量的線性范圍為0.008～0.064μg。

2.5 精密度試驗

取山柰酚和槲皮素混合標準品溶液，連續(xù)進樣5次，每次10μL，測定峰面積。結果，山柰酚和槲皮素峰面積的RSD分別為0.38%和1.19%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取室溫放置的同一批號的黃海棠供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、12h進樣10μL，測定峰面積。結果，山柰酚和槲皮素峰面積的RSD分別為1.68%和1.03%（n＝7），表明供試品溶液在12h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批號樣品6份，每份40mg，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，各進樣10μL，測定峰面積。結果，山柰酚和槲皮素峰面積的RSD分別為1.29%和1.44%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

稱取已知山柰酚和槲皮素質量分數的黃海棠粉末20mg，置于10mL容量瓶中，平行6份，分別加入等量山柰酚和槲皮素標準品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定質量分數，計算加樣回收率，結果分別見表1、表2。

表1 山柰酚的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab1 Results of recovery test of kaempferol（n＝6）

表2 槲皮素的加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab2 Results of recovery rate of quercetin（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取不同批次樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述方法測定黃海棠中山柰酚和槲皮素的含量，結果見表3。

表3 黃海棠中槲皮素與山柰酚的含量測定結果（g·g-1，n＝3）Tab3 Content determination of quercetin and kaempferide in H.ascyron（g·g-1，n＝3）

3 討論

3.1 流動相條件的選擇

在選擇分離條件時，曾選用甲醇-0.025mol·L-1磷酸水溶液和乙腈-0.025mol·L-1磷酸水溶液等[13，14]不同系統進行洗脫，結果表明，甲醇與磷酸水的體積比為60∶40、流速為1.0mL·min-1時分離效果最佳，山柰酚和槲皮素與其相鄰峰的分離度＞1.5，符合定量分析要求，且保留時間較短，分析較快。

3.2 提取條件的選擇

山柰酚和槲皮素溶于含水的醇，在此基礎上考察了體積分數分別為25%、50%、75%、100%的甲醇水溶液的提取效果，結果發(fā)現體積分數為50%的甲醇水溶液提取率最高。在50%甲醇水溶液提取的基礎上，又考察了提取時間10、20、30、40min，結果顯示在20min時已經提取完全，因此采用體積分數為50%的甲醇水溶液，提取20min。

本試驗首次建立了同時測定黃海棠中山柰酚和槲皮素含量的方法。該方法靈敏、準確、重復性好，可用于黃海棠藥材的質量控制。

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Content Determination of Kaempferol and Quercetin inHypericum ascyronby HPLC

ZHANG Wei
（Huanghe College of Science and Technology，Zhengzhou 450063，China）
ZHANG Wei，YU Hai-lin，SONG Yan-li，KANG Wen-yi
（Institute of Chinese Materia Medica，Henan University，Kaifeng 475004，China）

OBJECITVE：To establish the method for the content determination of kaempferol and quercetin inHypericum ascyron.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Purospher Star RP-C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.025mol·L-1phosphate（60∶40）at flow rate of 1.0mL·min-1.The column temperature was 25℃ and determination wavelength was set at 370nm.RESULTS：The linear ranges of kaempferol and quercetin was 0.0184～0.1288μg（r＝0.9998）and 0.008～0.064μg（r＝0.9999）.The average recoveries were 97.12%（RSD＝1.03%，n＝6）and 96.51%（RSD＝1.32%，n＝6）.CONCLUSION：The method is sensitive，accurate，and reproducible for the simultaneous determination of kaempferol and quercetin inH.ascyron.

Hypericum ascyron；HPLC；Kaempferol；Quercetin；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1790-03

Δ河南省科技廳重點攻關項目（102102310019）

＊講師，碩士研究生。研究方向：中藥活性成分。電話：0371-66607902。E-mail：zzzwwwqq@126.com

#通訊作者：教授。研究方向：中藥活性成分及新藥研發(fā)。電話：0378-3880680。E-mail：kangweny@hotmail.com

2011-02-28

2011-03-29）