康腦液2號(hào)對(duì)腦缺血再灌注大鼠VEGF、Ang-1與微血管密度的影響Δ

梁起保，鄒玉安，張曉麗，薛茜#，石會(huì)娟，李瑞羽

（1.河北北方學(xué)院，張家口市 075000；2.河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，張家口市 075000；3.河北張家口市電力物業(yè)管理公司門(mén)診部，張家口市 075000）

康腦液2號(hào)對(duì)腦缺血再灌注大鼠VEGF、Ang-1與微血管密度的影響Δ

梁起保1＊，鄒玉安2，張曉麗1，薛茜2#，石會(huì)娟1，李瑞羽3

（1.河北北方學(xué)院，張家口市 075000；2.河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，張家口市 075000；3.河北張家口市電力物業(yè)管理公司門(mén)診部，張家口市 075000）

目的：研究康腦液2號(hào)對(duì)腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）與微血管密度（MVD）的影響。方法：180只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為正常組、假手術(shù)組、模型組與康腦液2號(hào)高、中、低劑量組。線(xiàn)栓法復(fù)制大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型。大鼠缺血2h，于再灌注1、3、7、14、21d，免疫組化法檢測(cè)各組大鼠VEGF、Ang-1的表達(dá)，HE染色觀察大鼠腦組織病理改變；再灌注21d后免疫熒光法標(biāo)記細(xì)胞膜糖蛋白CD105，觀察新生血管，計(jì)算MVD。結(jié)果：與模型組比較，康腦液2號(hào)高、中、低劑量組病理變化更顯著，VEGF、Ang-1在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)顯著增高，腦梗死周?chē)鷧^(qū)域MVD顯著增大。結(jié)論：康腦液2號(hào)能改善腦缺血再灌注大鼠病理變化，保護(hù)梗死區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞，其機(jī)制可能與增加VEGF、Ang-1等促血管新生因子表達(dá)而促進(jìn)腦壞死周?chē)鷧^(qū)域血管新生有關(guān)。

康腦液2號(hào)；腦缺血再灌注損傷；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血管生成素-1；微血管密度

腦卒中是臨床常見(jiàn)疾病，在當(dāng)今生活及飲食習(xí)慣的影響下，該病有上升趨勢(shì)，是世界范圍內(nèi)主要致死和致殘的疾病之一。腦血管疾病在我國(guó)是位居第三的致死因素，其中缺血性腦血管?。↖schemic cerebrovascular disease，ICVD）可占到56.6%～80%，患者總?cè)藬?shù)可達(dá)500萬(wàn)～600萬(wàn)，存活者有高致殘率，高達(dá)約75%[1]，故對(duì)ICVD的防治非常重要。本課題組主要通過(guò)研究經(jīng)驗(yàn)方康腦液2號(hào)對(duì)腦缺血再灌注大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管生成素-1（Ang-1）與微血管密度（MVD）的影響來(lái)探索其對(duì)腦缺血再灌注大鼠的治療機(jī)制，從而為康腦液2號(hào)防治ICVD提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電腦生物組織包埋機(jī)、電腦生物組織攤烤片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；石蠟切片機(jī)、自動(dòng)脫水機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；BX60型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；顯微攝影裝置、E200型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試藥

康腦液2號(hào)由黃芪、當(dāng)歸、川芎、三七、葛根、地龍、丹參、鉤藤（后下）等藥味組成（藥材購(gòu)于河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院，經(jīng)河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院薛茜副主任醫(yī)師鑒定為真品），冷水浸泡過(guò)夜，煎煮2次，濾出藥渣，將2次煎取的藥液混勻，文火分別濃縮成400%、200%、100%康腦液2號(hào)（每1mL分別含生藥4、2、1g），4℃貯藏，備用；多聚甲醛（美國(guó)Sigma公司）；大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）栓線(xiàn)（北京沙東生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠一抗體及相應(yīng)二抗、熒光TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)成年SD大鼠180只，♂，體重200～280g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（京）2006-0008）。

2 方法

2.1 模型的復(fù)制

根據(jù)Longa EZ等[2]改良的方法，線(xiàn)栓經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈插線(xiàn)建立右側(cè)MCAO法復(fù)制大腦缺血再灌注模型。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常（等體積生理鹽水）、假手術(shù)（等體積生理鹽水）、模型（等體積生理鹽水）與康腦液2號(hào)高、中、低劑量（28.6、14.3、7.15g·kg-1）組，缺血2h，從手術(shù)后12h開(kāi)始ig給藥，每天1次，直至處死。

2.3 HE染色與VEGF、Ang-1蛋白標(biāo)記

于再灌注每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取每組6只大鼠，10%水合氯醛（300mg·kg-1）ip麻醉，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，依次灌入生理鹽水150mL、4%多聚甲醛200mL，前肢固定至肢體變硬，開(kāi)顱取腦，于前囟前2mm至前囟后3mm切腦，切塊厚度5mm，置入4%多聚甲醛中固定12～24h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。切片3μm，HE染色觀察腦梗死后病理變化，采用免疫組化法（S-P二步法，按說(shuō)明操作）檢測(cè)VEGF及Ang-1蛋白表達(dá)。

2.4 MVD檢測(cè)

于再灌注后21d，TRITC標(biāo)記細(xì)胞膜糖蛋白CD105顯示新生血管，簡(jiǎn)要步驟如下：切片脫蠟至水，PBS沖2min×3，室溫5%BSA封閉10min，甩去多余液體，滴加CD105一抗，4℃過(guò)夜，PBS沖3min×3，加TRITC標(biāo)記的二抗（1∶64），37℃1h，PBS沖洗2min×4，裱片，甘油封片。在發(fā)射波長(zhǎng)550nm、濾光波長(zhǎng)620nm熒光顯微鏡下觀察。切片經(jīng)圖像分析儀分析系統(tǒng)處理，參照Weidner N[3]的方法進(jìn)行MVD計(jì)數(shù)，每份標(biāo)本均選5個(gè)高倍視野（200×）計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，取平均值為該份標(biāo)本的平均微血管數(shù)（MMVC），以MMVC/mm2表示MVD（200×/高倍視野等于0.0426mm2）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0版本進(jìn)行處理，每組數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較用SNK法，P＜0.05為差異顯著。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦病理改變情況

光鏡下可見(jiàn)模型組梗死明顯，梗死主要位于基底節(jié)、皮質(zhì)下白質(zhì)和皮層，缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，殘存神經(jīng)細(xì)胞胞體縮小變性，細(xì)胞核固縮，胞漿濃縮呈深伊紅染色，神經(jīng)元纖維疏松，間質(zhì)水腫明顯，血管減少。康腦液2號(hào)低劑量組可見(jiàn)梗死范圍縮小，水腫程度較輕，神經(jīng)元形態(tài)改變也較輕，胞體完整，突起較清楚，基本保持完整，血管較模型組明顯增多。大鼠腦病理改變見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腦病理改變（HE，×100）A.正常組；B.康腦液2號(hào)低劑量組；C.模型組Fig1 Pathological change of cerebral tissue in rats（HE，×100）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

3.2 腦組織VEGF與Ang-1免疫組化結(jié)果

VEGF與Ang-1陽(yáng)性表達(dá)可見(jiàn)胞漿呈棕黃色，可表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞。正常組和假手術(shù)組表達(dá)較弱，模型組VEGF與Ang-1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.01或

P＜0.05）。與模型組比較，康腦液2號(hào)高、中、低劑量組VEGF

與Ang-1表達(dá)顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），VEGF表達(dá)高峰在7d，Ang-1表達(dá)高峰在14d?？的X液2號(hào)高、中劑量組顯著高于低劑量組（P＜0.05）。大鼠VEGF的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1、圖

2；大鼠Ang-1的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

3.3 大鼠腦MVD檢測(cè)結(jié)果

表1 大鼠VEGF的表達(dá)結(jié)果（±s）Tab1 Expression of VEGF in cerebral tissue of rat（s±s）

表1 大鼠VEGF的表達(dá)結(jié)果（±s）Tab1 Expression of VEGF in cerebral tissue of rat（s±s）

與正常組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組假手術(shù)組模型組康腦液2號(hào)高劑量組康腦液2號(hào)中劑量組康腦液2號(hào)低劑量組21d 5.35±2.785.45±2.4217.11±2.81＊＊22.32±2.33#22.13±2.19#19.20±2.96#VEGF/個(gè)數(shù)n 6666661d 5.34±2.815.86±2.439.23±2.45＊10.25±2.3310.36±2.3110.25±2.013d 5.35±2.245.97±1.8816.35±3.18＊＊29.25±4.04##28.96±3.88##22.66±3.32##7d 5.35±2.876.16±2.3232.51±3.54＊＊54.37±4.65##55.09±4.74##48.22±3.09##14d 5.36±2.015.88±1.2920.19±3.21＊＊34.52±4.21##33.82±4.02##30.01±3.89##

陽(yáng)性血管表達(dá)呈紅色。正常組與假手術(shù)組陽(yáng)性血管表達(dá)較少；模型組MVD顯著高于正常組（P＜0.01）。與模型組比較，康腦液2號(hào)高、中、低劑量組MVD顯著增高（P＜0.01或P＜0.05），康腦液2號(hào)高、中劑量組促血管新生能力顯著強(qiáng)于低劑量組（P＜0.05）。大鼠腦MVD的比較結(jié)果見(jiàn)表3；大鼠新生血管的表達(dá)見(jiàn)圖4。

4 討論

圖2 大鼠VEGF的表達(dá)（免疫組化，×400）A.正常組；B.康腦液2號(hào)低劑量組；C.模型組Fig2 Expression of VEGF in cerebral tissue of rats（immunohistochemistry，×400）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

腦缺血后引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括炎癥反應(yīng)、自由基超載、毒性氨基酸釋放等，但歸根結(jié)底無(wú)非是腦缺血缺氧導(dǎo)致，如果能早期恢復(fù)血供則可實(shí)現(xiàn)讓腦組織自己搭橋的夢(mèng)想。臨床工作中早期組織型纖溶酶原激活劑（T-PA）溶栓顯示出較好的臨床效果，證實(shí)了及時(shí)恢復(fù)血供、建立側(cè)枝循環(huán)對(duì)治療腦缺血的重要性。但T-PA溶栓指征苛刻，臨床上適合溶栓的患者非常少，所以開(kāi)發(fā)能促進(jìn)腦缺血周?chē)M織血管新生的藥物成為治療ICVD的重要策略。血管新生是在缺血組織已有的血管床上，內(nèi)皮細(xì)胞以牙生的方式長(zhǎng)出新支，形成血管網(wǎng)，使其功能與局部的需要相適應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程，主要靠促血管新生因子來(lái)促使其生成。VEGF是迄今發(fā)現(xiàn)最重要的一種促血管生成因子，其一方面能高選擇地促進(jìn)血管內(nèi)皮的有絲分裂，進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮的新生；另一方面，其還能增加血管內(nèi)皮的通透性，使血漿大分子物質(zhì)滲透到血管外的基質(zhì)中，從而為新生的血管提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4]。Ang-1在血管新生過(guò)程中也發(fā)揮著重大作用，主要機(jī)制如下：（1）使血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、聚集，吸引周?chē)?xì)胞形成新生血管；（2）拮抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；（3）促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形成管狀結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)VEGF等的血管穩(wěn)定作用；（4）調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)血管重塑、成熟，維持血管的完整性和穩(wěn)定性[5]。

表2 大鼠Ang-1的表達(dá)結(jié)果（±s）Tab2 Expression ofAng-1in cerebral tissue of rat（s±s）

表2 大鼠Ang-1的表達(dá)結(jié)果（±s）Tab2 Expression ofAng-1in cerebral tissue of rat（s±s）

與正常組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組假手術(shù)組模型組康腦液2號(hào)高劑量組康腦液2號(hào)中劑量組康腦液2號(hào)低劑量組Ang-1/個(gè)數(shù)n 6666661d 5.06±3.015.16±2.108.24±2.54＊8.26±2.528.36±2.488.25±2.013d 5.05±2.225.17±1.9811.25±3.63＊＊19.96±3.64##19.26±3.69##18.64±3.22##7d 5.05±2.975.16±2.5513.88±3.21＊＊20.08±3.55##20.19±3.64##18.22±3.17##14d 5.08±2.215.18±1.2920.19±5.01＊＊41.54±5.11##40.02±5.12##32.01±4.62##21d 5.06±2.965.15±3.1212.11±3.21＊＊14.21±2.22#14.22±2.28#14.20±2.21#

圖3 大鼠Ang-1的表達(dá)（免疫組化，×400）A.正常組；B.康腦液2號(hào)低劑量組；C.模型組Fig3 Expression of Ang-1in cerebral tissue of rats（immunohistochemistry，×400）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

表3 大鼠腦MVD的比較結(jié)果（±s，血管數(shù)/mm2）Tab3 Comparison of MVD in cerebral tissue of rat（s±s，MMVC/mm2）

表3 大鼠腦MVD的比較結(jié)果（±s，血管數(shù)/mm2）Tab3 Comparison of MVD in cerebral tissue of rat（s±s，MMVC/mm2）

與正常組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常組假手術(shù)組模型組康腦液2號(hào)高劑量組康腦液2號(hào)中劑量組康腦液2號(hào)低劑量組n 666666缺血再灌注21d 8.13±0.987.98±1.4338.22±3.25＊50.39±4.80##50.20±4.66##44.11±4.24#

圖4 大鼠新生血管的表達(dá)（×100）A.正常組；B.康腦液2號(hào)低劑量組；C.模型組Fig4 Expression of CD105of rats（×100）A.normal group；B.Kangnao liquidⅡ low dose group；C.model group

CD105不與大血管的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)，但對(duì)新生血管反應(yīng)性強(qiáng)，即與“活化”的內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性強(qiáng)，而對(duì)組織中正常的靜止?fàn)顟B(tài)下的血管內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)性弱[6]。本研究利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記CD105，能更好地顯示新生血管，更具有說(shuō)服力。

ICVD屬于中醫(yī)的中風(fēng)范疇，其主要病機(jī)為“素體氣虛，不能行血，以致血瘀”，所以治療原則主要為“益氣活血化瘀”?？的X液2號(hào)是臨床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方，適合氣虛血瘀患者，由益氣活血的鼻祖方補(bǔ)陽(yáng)還五湯按照現(xiàn)代人的特點(diǎn)化裁而來(lái)，由黃芪、當(dāng)歸、川芎、葛根、地龍、三七、丹參、鉤藤等組成。方中君藥以大量黃芪大補(bǔ)脾胃元?dú)猓沟脷馔?，瘀去絡(luò)通，并且活血祛瘀而不傷正；當(dāng)歸善于活血養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙，并和黃芪1∶5配伍為當(dāng)歸補(bǔ)血湯，充養(yǎng)脈絡(luò)，是為臣藥；川芎、葛根、地龍、三七、丹參等助當(dāng)歸活血化瘀，為佐藥；鉤藤、天麻引藥上行，是為使藥，君臣佐使共奏補(bǔ)氣活血化瘀之功。益氣活血法治療缺血再灌注損傷研究較多，嚴(yán)彬等[7]利用補(bǔ)氣活血中藥治療腎缺血再灌注模型大鼠，效果較好。更有田兆華等[8]研究證實(shí)，益氣活血代表方補(bǔ)陽(yáng)還五湯能明顯增多缺血腦組織新生血管數(shù)目。其余各單藥對(duì)腦梗死的治療作用也均有研究，有的已經(jīng)在臨床使用，比如川芎、丹參、葛根、三七等。

綜上所述，康腦液2號(hào)能增加MCAO大鼠VEGF、Ang-1的表達(dá)，促進(jìn)缺血腦組織血管新生，這可能是康腦液2號(hào)治療ICVD的機(jī)制所在。

[1] Jia Q，Liu LP，Wang YL.Stroke in China[J].Clin Exp Phar-macol Physiol，2010，37（2）：259.

[2] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranietomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84.

[3] Weidner N.Intratumor microvessle density as a prognostic factor in cancer[J].Am J Pathol，1995，147（1）：9.

[4]WangYQ，GuoX，QiuMH，et al.VEGF overexpression enhances stria-talneurogenesis in brain of adult rat after a transientmiddle cerebral artery occlusion[J].J Neurosci Res，2007，85（1）：73.

[5] 劉 帥，劉學(xué)政.Ang-1/Tie2系統(tǒng)與病理性血管形成的關(guān)系[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2010，16（1）：85.

[6] 于建憲，常 宏，紀(jì) 萍.CD105、CD34及Ⅷ因子在不同生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜中的表達(dá)[J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（3）：189.

[7] 嚴(yán) 彬，王建華，王旭東，等.補(bǔ)氣活血中藥對(duì)腎缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用研究[J].中國(guó)藥房，2005，16（9）：658.

[8] 田兆華，劉柏炎.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)局灶性腦缺血大鼠血管新生的影響[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2010，18（3）：193.

Effects of Kangnao Liquid Ⅱ on VEGF，Ang-1and MVD of Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

LIANG Qi-bao，ZHANG Xiao-li，SHI Hui-juan
（Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）
ZOU Yu-an，XUE Qian
（Dept.of Neurology，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）
LI Rui-yu
（Outpatient Department of Zhangjiakou Power Estate Management Company of Hebei Province，Zhangjiakou 075000，China）

OBJECTIVE：To investigate the influences of Kangnao liquid Ⅱ on vascular endothelial growth factor（VEGF），angiogenin-1（Ang-1）and MVD in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.METHODS：180healthy male SD rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group，Kangnao liquid Ⅱ high-dose，medium-dose and low-dose groups.Middle cerebral artery occlusion model was induced using suture method.Pathological changes were detected by HE staining and immunohistochemical method was used to investigate the expression of VEGF and Ang-1in rats on 1d，3d，7d，14d，21d of reperfusion injury after ischemia for 2h.Immunofluorescence labeling method was used to mark neovascular CD105after 21d of reperfusion and calculate MVD.RESULTS：Compared with model group，pathological changes of Kangnao liquidⅡhigh-dose，medium-dose，low-dose groups was better than that of model group.The expressions of VEGF and Ang-1increased at different time points significantly.MVD of cerebral infarction area was significant bigger than that of model group.CONCLUSION：Kangnao liquidⅡcan improve pathological change of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury and protect nerve cells of cerebral infarction focus.It may be associated with Kangnao liquidⅡcan increase the expression of VEGF and Ang-1to promote tissue angiogenesis.

Kangnao liquidⅡ；Cerebral ischemia reperfusion injury；Vascular endothelial growth factor；Angiogenin-1；MVD

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1740-04

Δ河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題（20090591）

＊碩士研究生。研究方向：缺血性腦血管疾病的用藥。E-mail：liangqibaoyisheng@126.com

#通訊作者：副主任醫(yī)師，副教授。研究方向：缺血性腦血管疾病。E-mail：xueqian6166@163.com

2010-10-17

2011-01-19）