RP-HPLC法測定人血漿中帕瑞昔布的濃度

李正翔，尹靜文，孫麗

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市 300052；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安市 271016；3.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市 300070）

RP-HPLC法測定人血漿中帕瑞昔布的濃度

李正翔1＊，尹靜文2，孫麗3

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市 300052；2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安市 271016；3.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市 300070）

目的：建立測定人血漿中帕瑞昔布的方法。方法：采用反相高效液相色譜法，血漿以無水乙醚提取后進(jìn)樣測定，色譜柱為Kromasil C18，流動相為乙腈-水（92∶8），內(nèi)標(biāo)為布洛芬，流速為1.0mL·min－1，檢測波長為209nm，最小進(jìn)樣間隔為30min。結(jié)果：帕瑞昔布血藥濃度在73.69～442.16μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.9992）；方法回收率為97.26%～99.24%，提取回收率為79.27%～80.51%，日內(nèi)和日間RSD均≤2.10%。結(jié)論：本方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以滿足帕瑞昔布血藥濃度的測定要求。

反相高效液相色譜法；帕瑞昔布；血藥濃度；藥動學(xué)

非甾體抗炎藥（NSAIDs）通過抑制環(huán)氧化酶（COX），以減少花生四烯酸轉(zhuǎn)化成前列腺素（PG）等炎癥介質(zhì)，達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的目的，是目前疼痛治療的常用藥物[1]。非選擇性的NSAIDs，雖能同時阻滯COX-1和COX-2，起到抗炎和止痛作用，但其胃腸道損害、腎臟損害和抑制血小板聚集等不良反應(yīng)卻限制了其進(jìn)一步使用?？诜x擇性的COX-2抑制劑如塞來昔布和羅非昔布（幾年前默克制藥公司在全球自愿召回羅非昔布（萬絡(luò)））能有效緩解中度疼痛，減少胃腸道反應(yīng)和抗血小板作用等不良反應(yīng)的發(fā)生，但對術(shù)后惡心、嘔吐以及不能口服藥物的患者也不是理想選擇[2，3]。因此，帕瑞昔布——一種可以通過靜脈注射或肌肉注射途徑使用的特異有效COX-2抑制劑，可能是最佳選擇[4～6]。帕瑞昔布2008年底開始在中國上市，之前只有美國和印度有相關(guān)的使用記錄。在國內(nèi)，該藥的臨床藥動學(xué)數(shù)據(jù)還相對缺乏。因此，需要建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確的測定該藥血藥濃度的方法。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀及其工作站（戴安中國有限公司）；UV-260紫外檢測儀（日本島津公司）；800型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）；LD5-2A離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；KQ218型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YKH-Ⅲ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）；CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）；通用型Adventurer分析天平（美國Ohaus公司）；YQ02.30型直聯(lián)旋片式真空泵（上海長江醫(yī)療器械廠）；101-A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司）；BS60電熱三用水箱（北京醫(yī)療器械廠）。

1.2 試藥

對照品：注射用帕瑞昔布鈉（輝瑞制藥有限公司，批號：AGUKB-85820001，含量：100.5%）；內(nèi)標(biāo)：布洛芬（中國藥品生物制品檢定所，批號：100.79-200303）；正常人空白血漿（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院輸血科提供）；氮?dú)猓∟2，六方高科技?xì)怏w廠，含量：99.999%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為市售分析純，純化水為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科自制。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250nm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（92∶8）；檢測波長：209nm，流速：1.0mL·min－1；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL；最小進(jìn)樣間隔：30min。

2.2 血漿樣品及溶液的制備

2.2.1 血漿樣品。將已加抗凝劑的正常血液置離心機(jī)上1500r·min－1離心10min，使血細(xì)胞與血漿分離，取上層血漿置于冰箱－20℃保存。使用時，室溫自然融化。

2.2.2 帕瑞昔布鈉對照品溶液。取干燥至恒重的注射用帕瑞昔布鈉約0.1g，準(zhǔn)確稱定為0.12221g（含帕瑞昔布鈉0.12282g），置于100mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.2282mg·mL－1帕瑞昔布鈉對照品溶液，置于2℃冰箱備用。用前閉塞超聲2min。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液。取內(nèi)標(biāo)布洛芬約0.05g，準(zhǔn)確稱定為0.05161g，置于50mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為1.0324mg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液，置于2℃冰箱備用。用前閉塞超聲2min。

2.3 正交試驗確定血漿樣品的處理方法

2.3.1 預(yù)試驗：取空白血漿0.5mL，依次加入帕瑞昔布鈉對照品溶液0.1mL、0.10mol·mL－1鹽酸溶液適量、內(nèi)標(biāo)（1.0324mg·mL－1布洛芬）溶液0.1mL、乙醚適量。渦旋振蕩10min，1500r·min－1離心2min，取上清液于40℃水浴下N2揮干后，殘渣加入0.10mol·mL－1氫氧化鈉溶液，超聲溶解后，再次于60℃水浴下N2揮干，殘渣加入流動相2mL超聲溶解后，取20μL，按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，帕瑞昔布和內(nèi)標(biāo)出峰時間均較適宜，且能達(dá)到良好的分離。

2.3.2 試驗方案。根據(jù)預(yù)試驗情況，確定考察因素為血漿樣品的pH值（A）（用鹽酸調(diào)節(jié)），加入的氫氧化鈉的體積與鹽酸體積的差值（B），乙醚量（C），每個因素安排3個水平進(jìn)行優(yōu)選，試驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平Tab1 Factors and levels

2.3.3 試驗結(jié)果。以確定的3因素3水平，按照L9（34）正交表的設(shè)計配制9份樣品，以帕瑞昔布的峰面積為指標(biāo)，進(jìn)行評定。正式試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果L9（34）Tab2 Results of L9（34）orthogonal test

如表2所示，通過極差分析可知，幾個因素對結(jié)果影響大小的順序是 C＞B＞A，且 A 因素：K1＞K2＞K3，B 因素：K1＞K3＞K2，C 因素：K2＞K1＞K3。所以最佳提取條件是 A1B1C2，即調(diào)節(jié)pH＝1、加堿量少于加酸量0.5mL、加乙醚4mL。

2.3.4 血漿樣品提取方法的確定。根據(jù)正交試驗，血漿樣品的處理方法為：取血漿0.5mL，用0.10mol·mL－1鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1，加入內(nèi)標(biāo)（1.0324mg·mL－1布洛芬）溶液0.1mL，乙醚4mL，渦旋振蕩10min，1500r·min－1離心2min，取上清液于40℃水浴下N2揮干后，殘渣加入0.10mol·mL－1氫氧化鈉（比鹽酸量少0.5mL），超聲溶解后，再次于60℃水浴下N2揮干，殘渣加入流動相2mL超聲溶解后，取20μL進(jìn)樣。

2.4 專屬性考察

吸取帕瑞昔布鈉對照品溶液0.12mL，加入到空白血漿0.5mL中，搖勻，配制成濃度為294.77μg·mL－1的血漿樣品。按“2.3.4”項下方法處理進(jìn)樣，并與血漿樣品及空白血漿比較，結(jié)果，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾帕瑞昔布和內(nèi)標(biāo)的測定。帕瑞昔布、內(nèi)標(biāo)布落芬的保留時間分別為3.00、4.05min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+帕瑞昔布對照品溶液+內(nèi)標(biāo)；C.血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；1.帕瑞昔布；2.布洛芬Fig1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+parecoxib control+internal standard；C.plasma sample+internal standard；1.parecoxib；2.ibuprofen

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

吸取帕瑞昔布鈉對照品溶液0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18mL，分別加入到空白血漿0.5mL中，搖勻，使其濃度分別為73.69、147.39、221.08、294.77、368.46、442.16μg·mL－1。按“2.3.4”項下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜。用帕瑞昔布峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）對濃度（c）作線性回歸，得回歸方程Y＝0.0089c+0.2101（n＝5，r＝0.9992）。結(jié)果表明，帕瑞昔布血藥濃度在73.69～442.16μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

吸取0.06、0.12、0.18mL的帕瑞昔布鈉對照品溶液，分別加入到空白血漿0.5mL中，搖勻，配制成濃度分別為147.39、294.77、442.16μg·mL－1的血漿樣品。按“2.3.4”項下方法處理，每個濃度的樣品分別于同日內(nèi)等時間間隔5次和連續(xù)5d內(nèi)5次提取進(jìn)樣，測定，將所得峰面積比值（Y）用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出帕瑞昔布濃度（c），考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗結(jié)果（n＝5）Tab3 Results of precision tests（n＝5）

2.7 提取回收率試驗

按“2.6”項下方法，配制3種濃度的血漿樣品，按“2.3.4”項下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜。將所得峰面積比值（Y），用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出帕瑞昔布濃度（c）。另相同濃度的帕瑞昔布鈉對照品溶液直接進(jìn)樣后，將所得峰面積比值（Y′），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出帕瑞昔布濃度（c′）。用c與c′的比值計算提取回收率，結(jié)果見表4。

表4 提取回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab4 Results of extraction recovery tests（n＝5）

2.8 加樣回收率試驗

取空白血漿0.5mL，向其中加入帕瑞昔布鈉對照品溶液，配制成低、中、高3種濃度的血漿樣品。再分別向其中加入相當(dāng)于血漿樣品含藥量80%、100%、120%的帕瑞昔布鈉對照品溶液，各平行制備5份，按“2.3.4”項下方法處理，記錄色譜。所得峰面積比值（Y），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出帕瑞昔布濃度（c），進(jìn)而得到測得量。按公式（加樣回收率＝（測得量－血漿樣品中帕瑞昔布量）/對照品加入量×100%）計算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab5 Results of recovery tests（n＝5）

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.5”項所示，配制成濃度為294.77μg·mL－1的血漿樣品9份。放置于－20℃冰箱，分別于0、24、72h后自然解凍，每個間隔3個樣品，按“2.3.4”項下方法處理，測定，結(jié)果測得濃度分別為（326.25±9.38）、（313.54±13.68）、（317.54±5.4）μg·mL－1，其RSD＝2.04%。表明血漿中帕瑞昔布在－20℃條件下中穩(wěn)定。

3 討論

3.1 提取方法對色譜行為的影響

本試驗采用了液-液萃取的方法。由于所用藥品帕瑞昔布鈉為水溶性的藥物，故先將其酸化降低極性后，再用乙醚提取，可有效增大提取回收率；之后，再用氫氧化鈉堿化，揮干，可有效降低雜質(zhì)峰對帕瑞昔布峰的影響，并且改善峰形。本試驗通過正交試驗，得出用鹽酸調(diào)節(jié)樣品至pH＝1、加入的氫氧化鈉比鹽酸少0.5mL最為適宜。

3.2 色譜條件對色譜行為的影響

3.2.1 檢測波長的選擇。將對照品稀釋100倍，用紫外檢測儀在200～400nm范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)在209nm和243nm波長處均有較大吸收，209nm波長處為最大吸收，因此選擇209nm為檢測波長。

3.2.2 內(nèi)標(biāo)的選擇。筆者考察了布洛芬，結(jié)果顯示，帕瑞昔布鈉在C18柱上的保留時間為3.0min左右，布洛芬的保留時間為4.0min左右，和帕瑞昔布峰的分離度（R）為5.5，分離效果較好，且布洛芬的出峰位置無雜質(zhì)峰干擾，符合生物樣品的測定要求。

3.2.3 流動相的選擇?？紤]到價格因素，筆者嘗試了用甲醇作流動相，但帕瑞昔布峰的峰面積不隨濃度的增大而成倍增加，可能的原因是甲醇極性較低，帕瑞昔布鈉在其中的溶解程度較低，不能得到良好的分離洗脫。對于流動相的配比，筆者分別用乙腈-水（92∶8）、乙腈-水（95∶5）、乙腈-水（90∶10）、乙腈-水（88∶12）作為流動相進(jìn)行試驗。結(jié)果，用乙腈-水（95∶5）作流動相，帕瑞昔布鈉與前面雜質(zhì)峰不能分開；用乙腈-水（88∶12）作流動相，帕瑞昔布鈉與后面雜質(zhì)峰不能分開；用乙腈-水（90∶10）作流動相，分離效果較好，但帕瑞昔布鈉峰形較鈍，均不符合測定要求。而用乙腈-水（92∶8）作流動相，峰形較好，且能達(dá)到良好的分離。

3.2.4 進(jìn)樣間隔時間考察。筆者發(fā)現(xiàn)在26min左右還有峰出現(xiàn)，因此把最小進(jìn)樣間隔時間定為30min。

3.3 對照品選擇

由于帕瑞昔布標(biāo)準(zhǔn)品無法獲得，所以采用已知含量的注射用帕瑞昔布鈉作為試驗對照品，文中所用數(shù)據(jù)均為經(jīng)標(biāo)示量百分含量折算后的數(shù)值。

本試驗以布洛芬為內(nèi)標(biāo)，采用無水乙醚提取揮干后進(jìn)樣的反相高效液相色譜法測定人血漿中帕瑞昔布濃度。在流動相為乙腈-水（92∶8）、流速為1.0mL·min－1、檢測波長為209nm、最小進(jìn)樣間隔為30min的色譜條件下，帕瑞昔布線性范圍為73.69～442.16μg·mL－1，線性關(guān)系良好，提取回收率較高，準(zhǔn)確度和精密度較高。該法簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于帕瑞昔布血藥濃度的測定。

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Concentration Determination of Parecoxib in Human Plasma by RP-HPLC

LI Zheng-xiang
（General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）
YIN Jing-wen
（School of Pharmacy，Taishan Medical College，Taian 271016，China）
SUN Li
（School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

OBJECTIVE：To develop a method for the concentration determination of parecoxib in human plasma.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The plasma sample was extracted with absolute ether.The determination was performed on Kromasil-C18（250nm×4.6nm，5μm）column with mobile phase consisted of acetontrile-water（92∶8）at the flow rate of 1.0mL·min－1.Ibuproren（IBF）was used as internal standard and UV detection wavelength was set at 209nm.Minimum injection interval was 30min.RESULTS：The linear range of parecoxib was 73.69～442.16μg·mL－1（r＝0.9992）.The method recovery was 97.26%～99.24%and extraction recovery was 79.27%～80.51%.The RSD of intra-day and inter-day were less than 2.10%.CONCLUSION：The method is simple，rapid，accurate，reproducible and suitable for the determination of parecoxib concentration in human plasma.

RP-HPLC；Parecoxib；Plasma concentration；Pharmacokinetics

R969.1；R971+.1

A

1001-0408（2011）18-1675-03

＊主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：020-60363702。E-mail：Lee41@sina.com

2010-07-06

2011-03-01）