未折疊蛋白反應(yīng)在強(qiáng)噪聲致豚鼠耳蝸細(xì)胞損傷過程中的作用

薛秋紅 陳小林 龔樹生 謝靜 陳佳 何堅(jiān)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)和儲(chǔ)存鈣離子的場所，許多理化因素可以導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蓄積以及細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，這種狀態(tài)稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，近年來有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號(hào)通路與效應(yīng)的研究已成為熱點(diǎn)。未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的信號(hào)通路之一，UPR以位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Bip/GRP78)顯著增加為特征，UPR激發(fā)Bip/GRP78高表達(dá)，通過協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、裝配和運(yùn)輸來維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，保護(hù)細(xì)胞[1]。有研究表明 UPR在Alzheimer’s病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中有重要作用[2],但其在噪聲性聾方面的研究不多。本研究通過觀察強(qiáng)噪聲暴露后不同時(shí)期豚鼠耳蝸細(xì)胞UPR標(biāo)志物Bip/GRP78的表達(dá)，探討UPR在噪聲暴露后豚鼠耳蝸細(xì)胞損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康白色紅目雄性豚鼠48只，體重400～450 g，耳廓反射靈敏，鼓膜完整，無中耳炎，無耳毒性藥物應(yīng)用史及噪聲接觸史。動(dòng)物隨機(jī)分為6組，即健康對(duì)照組和噪聲暴露后3 h、1 d、4 d、14 d、30 d組，每組8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，健康對(duì)照組不給噪聲暴露，后5組給予強(qiáng)噪聲暴露4 h。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1噪聲刺激 噪聲由軟件4 kHz NBN-316 Hz BW-50 mV(解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所自制并惠贈(zèng)) 經(jīng)筆記本電腦聲卡產(chǎn)生，經(jīng)功率放大器放大傳至揚(yáng)聲器，揚(yáng)聲器置于80 cm×80 cm×85 cm的雙層隔音箱四角，實(shí)驗(yàn)豚鼠置于35 cm×35 cm×50 cm的飼養(yǎng)籠中，自由進(jìn)水。豚鼠活動(dòng)范圍內(nèi)聲強(qiáng)相差最大不超過5 dB。用HS6280型噪聲頻譜分析儀(中國江西國營紅聲器材廠)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，測得噪聲頻率為中心頻率4 kHz的窄帶噪聲，聲級(jí)計(jì)測量噪聲強(qiáng)度為120 dB SPL,暴露時(shí)間為4 h。

1.2.2聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 對(duì)照組和噪聲暴露后各組豚鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死前行ABR檢測。動(dòng)物以10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔麻醉，在靜電屏蔽室內(nèi)測試。采用Nicolet Compass 系統(tǒng),刺激聲為click，重復(fù)率為20次/秒, 掃描周期10 ms，濾波帶寬100～3 000 Hz，信號(hào)疊加1 024次，以波Ⅲ為標(biāo)準(zhǔn)判斷反應(yīng)閾。測試后處死動(dòng)物，每組取4只豚鼠耳蝸?zhàn)魇炃衅?只提取耳蝸總蛋白。

1.2.3耳蝸石蠟切片 動(dòng)物以10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉后，仰臥固定，開胸暴露心臟，灌流沖洗，隨后灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH 7.4)300～500 ml,快速斷頭取出雙側(cè)聽泡，兩窗灌注同種液體，放在4%多聚甲醛磷酸緩沖液中4 ℃下過夜，修剪后置入10%乙二胺四乙酸二鈉(pH 6.8)充分脫鈣3周左右。常規(guī)石蠟包埋，平行于蝸軸方向連續(xù)切片，片厚5 μm,烘干，室溫儲(chǔ)藏備用。

1.2.4Bip/GRP78免疫組化染色 耳蝸組織切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2孵育10 min，蒸餾水沖洗；滴加抗原修復(fù)液1～3滴，孵育10 min，10%正常羊血清封閉20 min；滴加羊多抗Bip/GRP78(1：100稀釋，美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)(其余試劑均由中山公司提供)，4℃過夜(陰性對(duì)照用正常羊血清代替一抗)；加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，滴加SABC反應(yīng)液1～2滴，37 ℃DAB顯色；Mayer蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，透明、封片，顯微鏡(×400)觀察照相。Bip/GRP78染色陽性表現(xiàn)為胞漿/膜中有棕黃色顆粒分布。

1.2.5Western Blot檢測Bip/GRP78蛋白 處死動(dòng)物，提取雙耳耳蝸總蛋白, 分別用10%SDS - PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉1 h；加入羊多克隆Bip/GRP78抗體(1:400，為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品,),抗β-actin單克隆抗體(1：400 ，Sigma,美國),4 ℃孵育24 h,洗膜(5 min,3次),加1：5 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育60 min,洗膜,顯色,曝光。

Bip/GRP78免疫組化染色切片由新9．0版HPIAS-100高清晰度彩色病理圖像免疫組化測量系統(tǒng)，在400倍視野下，測每組Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、側(cè)壁細(xì)胞染色的平均吸光度值。為減少誤差，固定對(duì)每張切片第2、3 回以上部位的細(xì)胞進(jìn)行吸光度測定。在每組中隨機(jī)選擇400個(gè)受檢細(xì)胞做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)算每組的平均吸光度值。Bip/GRP78蛋白條帶采用Kodak Digital Science ID 圖像分析系統(tǒng)(USA)進(jìn)行光密度值測定,分別與以β-actin光密度值的比值代表Bip/GRP78蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ABR閾值 各組ABR閾值見表1?？梢姡c對(duì)照組比較，噪聲暴露后各組ABR閾值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組豚鼠ABR反應(yīng)閾(n=8只)

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.2Bip/GRP78免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果 噪聲暴露后各組均可見Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及耳蝸側(cè)壁的細(xì)胞質(zhì)/膜上有染色程度不等的棕黃色顆粒分布(圖1)，正常對(duì)照組染色弱陽性。經(jīng)圖像分析，各組Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及耳蝸側(cè)壁的Bip/GRP78蛋白免疫組化染色平均吸光度值見表2，噪聲暴露后各組Bip/GRP78蛋白Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)及耳蝸側(cè)壁的平均吸光度值與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，暴露后30 d組與暴露后3 h、1 d、4 d、14 d組Bip/GRP78蛋白差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而暴露后3 h、1 d、4 d、14 d組間Bip/GRP78蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組豚鼠耳蝸各部位Bip/GRP78免疫組化染色的平均吸光度值(n=4只)

注：*與對(duì)照組同一部位比較，P<0.01；▲與暴露后3 h、1 d、4 d、14 d組同一部位比較，P<0.01

圖1 光鏡下耳蝸各部位Bip/GRP78的表達(dá)(免疫組化SP染色×400)a、b、c為暴露后3 h組的Corti器、側(cè)壁、螺旋神經(jīng)節(jié)的Bip/GRP78免疫組化SP染色強(qiáng)陽性細(xì)胞(箭頭所示) ，d、e、f為對(duì)照組Corti器、側(cè)壁、螺旋神經(jīng)節(jié)Bip/GRP78免疫組化SP染色弱陽性細(xì)胞(箭頭所示)

2.3Bip/GRP78蛋白的Western Blot檢測 Bip/GRP78蛋白的Western Blot法檢測蛋白變化條帶見圖2?？梢姳┞逗蟾鹘M表達(dá)明顯增高，而且在暴露后3 h、1 d、4 d、14 d組時(shí)達(dá)到高峰，30 d時(shí)減弱，對(duì)照組Bip/GRP78表達(dá)較少。經(jīng)圖像分析并以Bip/GRP78蛋白與β-actin平均光密度比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果暴露后各組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，暴露后30 d組與暴露后3 h、1 d、4 d、 14 d組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但暴露后3 h、1 d、4 d、 14 d組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Western Blot法檢測Bip/GRP78蛋白的變化

3 討論

Bip/GRP78又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白,與熱休克蛋白70(Hsp70)家族具有高度同源性，存在于各類哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志分子伴侶，其表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志之一。近年來認(rèn)為細(xì)胞受刺激時(shí)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)激發(fā)Bip/GRP78高表達(dá)可能是細(xì)胞的一種重要的防御機(jī)制[1]。

目前對(duì)噪聲性聾的發(fā)病機(jī)制的研究較多,包括興奮性氨基酸毒性、鈣超載、氧化應(yīng)激反應(yīng)等，其中氧化應(yīng)激、鈣超載與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系密切[3]。強(qiáng)噪聲刺激作為一種應(yīng)激源可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),而Bip/GRP78表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，噪聲暴露后3 h、1 d、4 d、14 d、30 d時(shí)豚鼠耳蝸Bip/GRP78的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組。Bip/GRP78的表達(dá)上調(diào)表明強(qiáng)噪聲誘導(dǎo)了耳蝸細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，其機(jī)制可能是鈣超載和大量氧自由基生成的三磷酸腺苷消耗增加，非折疊蛋白反應(yīng)加劇，Bip/GRP78蛋白合成在某種機(jī)制調(diào)控下加速，從而阻止進(jìn)一步的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，當(dāng)然其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。從文中結(jié)果看，在噪聲暴露后3 h到30 d，Bip/GRP78一直保持高表達(dá)，這可能與強(qiáng)噪聲暴露后耳蝸細(xì)胞發(fā)生次級(jí)損傷有關(guān)；Hu等[4]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)強(qiáng)噪聲暴露后豚鼠耳蝸從暴露后1 d到14 d不斷有新的細(xì)胞損傷在發(fā)生，損傷的區(qū)域也在持續(xù)擴(kuò)大；次級(jí)損傷的發(fā)生通過刺激耳蝸細(xì)胞Bip/GRP78的持續(xù)高表達(dá)，來阻止進(jìn)一步或持久的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)損傷不嚴(yán)重的細(xì)胞起保護(hù)作用，從而使其恢復(fù)正常功能。本研究中，豚鼠聽力損失在噪聲暴露后3 h最嚴(yán)重，而暴露后4 d到14 d聽力損失逐漸減輕，也證實(shí)Bip/GRP78的表達(dá)上調(diào)，維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而使大量損傷較輕的細(xì)胞逐漸恢復(fù)。因此,本文結(jié)果提示Bip/GRP78蛋白的高表達(dá)對(duì)強(qiáng)噪聲引起的耳蝸細(xì)胞損傷可能具有一定的保護(hù)作用，而且這種保護(hù)作用從暴露后3小時(shí)開始一直可以持續(xù)到暴露后30天，30天后由于強(qiáng)噪聲對(duì)內(nèi)耳細(xì)胞損害逐漸減弱，Bip/GRP78蛋白的表達(dá)也相對(duì)減少。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，Bip/GRP78陽性細(xì)胞分布在毛細(xì)胞、耳蝸側(cè)壁及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上，說明Bip/GRP78不僅對(duì)毛細(xì)胞起保護(hù)作用而且對(duì)整個(gè)內(nèi)耳細(xì)胞都起保護(hù)作用；當(dāng)然這種保護(hù)作用是相對(duì)的，UPR既誘導(dǎo)促細(xì)胞存活信號(hào)，又誘導(dǎo)促細(xì)胞凋亡信號(hào)，對(duì)受損嚴(yán)重的細(xì)胞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)會(huì)通過凋亡等方式清除這些細(xì)胞[5]。綜上所述，推測豚鼠強(qiáng)噪聲暴露后，啟動(dòng)UPR保護(hù)機(jī)制，通過上調(diào)分子伴侶Bip/GRP78的表達(dá)，引導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊，降低細(xì)胞損傷，這可能是內(nèi)耳細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制之一。

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