早期氣導(dǎo)聽覺剝奪對(duì)幼鼠聽覺發(fā)育的影響△

王楓 王方圓 黑任軼 劉順利 米文娟 陳陽 邱建華

動(dòng)物出生后神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與環(huán)境密切相關(guān)，研究表明，早期聲環(huán)境的改變，可對(duì)大鼠聽覺的發(fā)育產(chǎn)生重要影響[1,2]。改變嗅覺、視覺和聽覺系統(tǒng)中感覺輸入信號(hào)會(huì)影響相應(yīng)系統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在形態(tài)和功能上的發(fā)育與成熟[3～5]。聽覺剝奪效應(yīng)是1996 年由15位著名聽力學(xué)家組成的Eriksholm工作組討論提出，并定義為由于聲學(xué)信息的減少導(dǎo)致的聽覺功能逐漸下降[6]。本研究旨在觀察大鼠聽覺發(fā)育早期氣導(dǎo)聽覺剝奪對(duì)Corti器發(fā)育及聽力的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)SD乳鼠60只，雌雄不拘，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分為對(duì)照組和聽覺剝奪組，每組30只。聽覺剝奪組于出生后12天行雙外耳道填塞，飼養(yǎng)于密閉隔聲室，42天時(shí)去除填塞物，開放外耳道在正常聲音環(huán)境飼養(yǎng)；對(duì)照組動(dòng)物在正常食水、正常聲音環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2外耳道堵塞方法 SD仔鼠生后12天時(shí)行外耳道填塞，選取助聽器耳模材料，適量大小，塑形后待其半凝固，沿外耳道方向置入耳道口，有機(jī)粘合劑固定。每天觀察耳道，填塞物如有脫落，立即補(bǔ)填。動(dòng)物較大時(shí)則以2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)行腹腔注射麻醉后填塞耳道，并以手術(shù)縫線縫合外耳道口，以免抓脫。

1.3聽性腦干反應(yīng)檢測(cè) 分別于出生后21、28、35、42、56 d采用聽覺電生理檢測(cè)儀(Biologic，Traveler Express E，USA)對(duì)兩組大鼠行ABR檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以2%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)行腹腔注射麻醉。聽覺剝奪組取出耳道填塞物后進(jìn)行檢測(cè)。記錄電極刺入矢狀縫與兩外耳道連線交點(diǎn)頭皮下，參考電極放置在刺激耳后皮下，接地電極放置在大鼠尾根部皮下。交替短聲刺激，聲源距外耳孔1.0 cm，刺激間隔為0.1 ms，濾波帶通為100～2 000 Hz，掃描時(shí)間為10 ms，疊加次數(shù)512次。以剛剛出現(xiàn)可以辨認(rèn)的波Ⅱ或波Ⅲ為標(biāo)準(zhǔn)記錄ABR反應(yīng)閾。

1.4掃描電鏡標(biāo)本制備 對(duì)照組和聽覺剝奪組分別于出生后42、56天各隨機(jī)抽取3只大鼠，行掃描電鏡標(biāo)本制備：動(dòng)物先行戊巴比妥鈉腹腔麻醉，4%多聚甲醛、1.5%戊二醛混合液灌注固定，取耳蝸在解剖顯微鏡下剝?nèi)ス菤?，去除螺旋韌帶，撕去蓋膜，顯露基底膜，立即放入3%戊二醛(pH 7.2)中固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，梯度丙酮脫水后用梯度醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥儀干燥，離子濺射儀噴金鍍膜，掃描電鏡下觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ABR檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1ABR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組大鼠聽性腦干反應(yīng)閾值隨年齡增長呈下降趨勢(shì)，35、42、56天時(shí)ABR閾值均較21天時(shí)顯著下降(P<0.01)，56天時(shí)ABR閾值基本達(dá)到正常成年大鼠水平。

聽覺剝奪組大鼠35天時(shí)聽性腦干反應(yīng)閾值顯著增高，42天時(shí)仍較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)。42天后開放外耳道恢復(fù)氣導(dǎo)聲音刺激，至56天時(shí)聽性腦干反應(yīng)閾值仍較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)。隨年齡增長聽覺剝奪組聽性腦干反應(yīng)閾值下降趨勢(shì)消失，35、42、56天的反應(yīng)閾比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2掃描電鏡結(jié)果 對(duì)照組大鼠耳蝸基底膜掃描電鏡觀察顯示外毛細(xì)胞纖毛排列整齊，無毛細(xì)胞缺失及纖毛排列紊亂(圖1A)。聽覺剝奪組42天時(shí)可見基底膜各類細(xì)胞表面均產(chǎn)生大量細(xì)小囊泡樣改變，外毛細(xì)胞纖毛末端膨大，大部分融合(圖1B)，56天時(shí)基底膜表面改變與42 d時(shí)類似，但程度稍輕(圖1C)。

表1 兩組大鼠出生后不同時(shí)間聽性腦干反應(yīng)閾值

注：*與對(duì)照組21天時(shí)比較，P<0.01；# 與對(duì)照組同天齡比較，P<0.01

圖1 各組動(dòng)物外毛細(xì)胞纖毛掃描電鏡結(jié)果

3 討論

大鼠生后聽力發(fā)育的“關(guān)鍵期”一般認(rèn)為從第12天開始，到第30天結(jié)束[7, 8]。眾多研究表明，早期聲音信號(hào)刺激可誘導(dǎo)聽覺神經(jīng)中樞的發(fā)育和成熟，聽覺剝奪則具有延緩大鼠上外橄欖核(lateral superior nucleus，LSO)神經(jīng)元抑制性突觸發(fā)育的作用[9, 10]。Sanes等[11]研究報(bào)道，破壞出生后一周大鼠的耳蝸則可阻斷與抑制性突觸相關(guān)的軸索和樹突正常形態(tài)學(xué)再變構(gòu)的過程。同樣，破壞幼年沙鼠耳蝸?zhàn)钄嗦曒斎胍簿哂凶钄郘SO神經(jīng)元抑制性突觸和樹突的形態(tài)發(fā)育的作用[12]。然而早期氣導(dǎo)聽覺剝奪對(duì)Corti器發(fā)育的影響尚不清楚。

本研究在大鼠出生后12～42天聽覺發(fā)育早期對(duì)其進(jìn)行氣導(dǎo)聽覺剝奪，觀察氣導(dǎo)聽覺剝奪對(duì)大鼠Corti器發(fā)育及聽力的影響，結(jié)果可見大鼠早期聽覺刺激在聽覺發(fā)育和成熟過程中起著關(guān)鍵的作用，正常對(duì)照組大鼠聽覺發(fā)育隨年齡增長逐漸成熟，聽性腦干反應(yīng)閾值隨年齡增長逐步下降，56天時(shí)基本達(dá)到正常成年大鼠水平。早期氣導(dǎo)聽覺剝奪組大鼠35天時(shí)聽覺發(fā)育明顯受損，聽性腦干反應(yīng)閾值顯著增高，42天時(shí)開放外耳道恢復(fù)氣導(dǎo)聲音刺激后，至56天時(shí)聽力無明顯改善。掃描電鏡可觀察到早期聽覺剝奪后大鼠耳蝸基底膜多種細(xì)胞表面產(chǎn)生大量細(xì)小囊泡樣改變以及外毛細(xì)胞損傷，可見人為減少聽覺發(fā)育關(guān)鍵期聲音信號(hào)的傳入，可影響Corti器毛細(xì)胞的發(fā)育，聽覺發(fā)育關(guān)鍵期過后，再給予正常聲音刺激已經(jīng)不能逆轉(zhuǎn)這種影響。文中結(jié)果說明氣導(dǎo)聲音刺激在大鼠聽覺感受器發(fā)育過程中起著十分重要的作用。

本研究通過聽覺電生理、掃描電鏡等方法證實(shí)氣導(dǎo)聲音信號(hào)刺激在Corti器發(fā)育過程中具有重要的促進(jìn)作用，為臨床聽覺發(fā)育異常疾病的診斷、治療和預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)。氣導(dǎo)聲音信號(hào)促進(jìn)Corti器正常發(fā)育的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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