慢性氟中毒大鼠內(nèi)耳組織線粒體DNA缺失的實(shí)驗(yàn)研究△

陶學(xué)勇 陳乾美 耿勇 李皓琳 劉敏 翟性友

慢性氟中毒是無(wú)機(jī)氟在體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積所引起的全身器官和組織的毒性損害[1]，氟中毒對(duì)骨骼、牙齒、神經(jīng)系統(tǒng)等全身多器官的損害已被人們所公認(rèn)。氟造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究中，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)氟中毒患者可出現(xiàn)不同程度的聽(tīng)覺(jué)功能損害[2]，但聽(tīng)覺(jué)損害的部位、機(jī)制尚不十分明確。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，線粒體DNA突變與耳聾發(fā)病的關(guān)系越來(lái)越受到重視，許多耳聾者都伴有各種線粒體DNA突變[3]。本研究通過(guò)對(duì)慢性氟中毒大鼠行畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emissions，DPOAE)測(cè)試及內(nèi)耳組織線粒體DNA(mtDNA)片段缺失突變的觀察，擬進(jìn)一步探討氟中毒對(duì)聽(tīng)力影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇體重60～100 g的健康SD大鼠60只(由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不分, 耳廓反射靈敏，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，低氟組和高氟組，每組20只。

1.2慢性氟中毒大鼠造模 正常對(duì)照組20只大鼠喂飼普通飼料(氟含量0.92 mg/kg)(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。低氟組、高氟組大鼠分別喂飼含20%、75%的燃煤型氟病區(qū)烘烤玉米的混合飼料，氟含量分別為35.1、105.0 mg/kg，各組大鼠均飲用自來(lái)水，喂養(yǎng)6個(gè)月后體重350～480 g。期間觀察大鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況及氟斑牙情況，監(jiān)測(cè)體重、尿氟含量指標(biāo)。氟斑牙分級(jí)[4]:0級(jí)(正常)：釉質(zhì)黃色半透明；1級(jí)(極輕)：釉質(zhì)渾濁或見(jiàn)隱約白紋；2級(jí)(輕度)：釉質(zhì)明顯渾濁，白色條帶沿釉質(zhì)橫紋分布；3級(jí)(中度)：釉質(zhì)失去光澤，見(jiàn)棕白色相間條紋；4級(jí)(重度)：牙體缺損。

1.3尿氟收集及測(cè)定 每月及處死動(dòng)物前收集一次 12 小時(shí)尿, 采用氟離子電極法測(cè)定尿氟。

1.4DPOAE測(cè)試 各組動(dòng)物均于飼養(yǎng)后6個(gè)月分別進(jìn)行DPOAE測(cè)試，記錄雙耳DPOAE反應(yīng)幅值[5]。

1.5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(plymerase chain reaction，PCR)測(cè)試 動(dòng)物行DPOAE測(cè)試后快速斷頭，打開(kāi)顳骨，取出聽(tīng)泡,解剖顯微鏡下分離耳蝸，去除半規(guī)管、前庭神經(jīng)和中耳結(jié)構(gòu)。沿聽(tīng)神經(jīng)中樞端分離蝸核組織。取顳肌組織約1克。上述組織分離后迅速置于-70 ℃冰箱備用。線粒體DNA提取參考文獻(xiàn)[6]，使用引物對(duì)L4395 (5’-ACTTAACCAGACCCAAACACG-3’，4395-4418)和H5164 (5’- CCTCTTTTCTGATAGGCGGG-3’,5164-5145)擴(kuò)增野生型mtDNA片段，長(zhǎng)度770 bp。使用引物對(duì)L8022 (5’-ACCGACTACACTCATTTCAAC-3’，8022-8042)和H13117 (5’- AAGCCTGCTAGGATGCTTC -3’, 13117-13099)擴(kuò)增缺失型mtDNA片段，長(zhǎng)度262 bp。若模板內(nèi)存在mtDNA4834缺失，電泳結(jié)果可見(jiàn)262 bp條帶，說(shuō)明mtDNA4834缺失陽(yáng)性。PCR方法：總體系 25 μl，包括TaqDNA 聚合酶0.5 μl、引物1(15 μmol) 1 μl、l10×buffer 2.5 μl、引物2(15 μmol) 1 μl、4×dNTP 2 μl、模板 2 μl、25 mmol/L MgCl21.5 μl。PCR擴(kuò)增條件為： 94 ℃ 預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，退火56 ℃ 30 s，72 ℃延伸50 s， 72 ℃ 8 min,反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。各組PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙啶染色,凝膠成像儀成像并保存結(jié)果。缺失型PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后,其產(chǎn)物送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組mtDNA4834缺失的發(fā)生率比較用χ2檢驗(yàn)，各組之間DPOAE反應(yīng)幅值比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育狀況及氟斑牙情況 對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。 實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡、毛發(fā)干燥、活動(dòng)減少, 攝氟量越高生長(zhǎng)狀態(tài)越差。大鼠飼養(yǎng)至 3 個(gè)月, 高氟組出現(xiàn)4級(jí)氟斑牙;大鼠飼養(yǎng)至6 個(gè)月, 低氟組出現(xiàn)3級(jí)氟斑牙。

2.2各組大鼠不同時(shí)間尿氟測(cè)定結(jié)果 隨喂養(yǎng)時(shí)間推移, 氟中毒組大鼠尿氟呈上升趨勢(shì)。在各檢測(cè)時(shí)間段高氟組和低氟組大鼠尿氟均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(表1)。

2.3DPOAE測(cè)試結(jié)果 各組DPOAE 測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2,低氟組、高氟組8 kHz反應(yīng)幅值與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ,0.5、1、2、4 kHz各組反應(yīng)幅值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4mtDNA缺失片段擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè) 分別用引物對(duì)高氟組、低氟組和正常對(duì)照組的耳蝸、蝸核和顳肌組織提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，高氟組、低氟組大鼠耳蝸、蝸核組織可擴(kuò)增到所預(yù)期的262 bp條帶，證明存在mtDNA4834缺失，氟中毒組大鼠內(nèi)耳組織可擴(kuò)增到262條帶缺失發(fā)生率明顯高于顳肌組織；正常對(duì)照組大鼠耳蝸、蝸核和顳肌組織擴(kuò)增到262 bp條帶的缺失發(fā)生率很低(圖1)。

表1 各組大鼠不同時(shí)間尿氟測(cè)定結(jié)果

表2 各組大鼠不同頻率畸變耳聲發(fā)射反應(yīng)幅值比較

注:*與對(duì)照組比較，P<0.05

圖1 高氟組、低氟組、正常對(duì)照組大鼠耳蝸、蝸核、顳肌組織以引物對(duì)擴(kuò)增的mtDNA野生型和缺失型片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

M為Marker，1～3 依次為高氟組大鼠顳肌、蝸核、耳蝸組織；4～6 依次為低氟組大鼠顳肌、蝸核、耳蝸組織；7～9 正常對(duì)照組組大鼠顳肌、蝸核、耳蝸組織。所有標(biāo)本均可擴(kuò)增出770 bp的線粒體DNA保守片段，存在4834缺失的標(biāo)本可以擴(kuò)增出262 bp的線粒體DNA缺失片段高氟組、低氟組、正常對(duì)照組大鼠mtDNA4834缺失的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，可見(jiàn)，高氟組大鼠耳蝸和蝸核組織均存在普遍的mtDNA4834缺失，顳肌組織中mtDNA4834缺失發(fā)生率較低，對(duì)照組大鼠耳蝸、蝸核組織中mtDNA4834缺失發(fā)生率明顯低于高氟組及低氟組(P<0.01)，各組顳肌組織中mtDNA4834缺失發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠耳蝸、蝸核、顳肌mtDNA4834缺失發(fā)生率(%)

注：*與對(duì)照組比較，P<0.01

3 討論

Kemp等[6]認(rèn)為,采用DPOAE測(cè)試耳蝸功能快速靈活, 所測(cè)的頻率更寬。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與低氟組、高氟組8 kHz DPOAE反應(yīng)幅值差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明慢性氟中毒能導(dǎo)致大鼠高頻聽(tīng)功能的損害，并且隨著氟中毒的加重, 聽(tīng)力損害亦加重。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，應(yīng)用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)慢性氟中毒可致內(nèi)、外毛細(xì)胞的纖毛發(fā)生粘連、倒伏、融合、缺失等病理改變，并以耳蝸底回明顯,從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了氟中毒對(duì)聽(tīng)功能影響的可能機(jī)制。有研究表明[8]，ABR閾值升高的大鼠耳蝸和蝸核中存在mtDNA缺失，可能與聽(tīng)覺(jué)敏感性下降有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性氟中毒導(dǎo)致的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失大鼠(包括高氟組和低氟組)的耳蝸、蝸核組織可發(fā)生mtDNA4834缺失，其缺失發(fā)生率明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)；而慢性氟中毒組中與聽(tīng)覺(jué)無(wú)關(guān)的顳肌組織mtDNA4834缺失發(fā)生率很低，與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示mtDNA4834缺失與慢性氟中毒引起的感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失有關(guān)。氟中毒導(dǎo)致mtDNA損害的機(jī)制尚不是十分清楚，考慮為多方面機(jī)制相互協(xié)同作用的結(jié)果，可能為：①通過(guò)氧自由基損害作用，自由基代謝紊亂是氟中毒發(fā)病中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[9]；自由基可以改變正常細(xì)胞周期，導(dǎo)致細(xì)胞周期折返，誘發(fā)受累細(xì)胞凋亡[10]；②氟影響線粒體膜內(nèi)外Ca2+的平衡及細(xì)胞的功能：慢性氟中毒時(shí)可存在細(xì)胞膜鈣通道迅速開(kāi)放，鈣內(nèi)流增多，使細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平明顯增高[11]。mtDNA片段缺失到一定程度后可使呼吸鏈合成蛋白發(fā)生障礙，ATP產(chǎn)生減少，而ATP對(duì)毛細(xì)血管和血管紋等維持內(nèi)耳離子平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定非常重要[12]。目前氟中毒造成mtDNA缺失的確切機(jī)制還不十分明確，有待于分子水平上的進(jìn)一步探討。

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