重組腺病毒載體介導外源性XIAP抑制聽皮層GABA能神經元凋亡與老年性聾相關性研究進展＊

胡玥 綜述 姬長友 陳繼川 審校

1 第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 耳鼻咽喉－頭頸外科（重慶 400042）

老年性聾是一類隨年齡增長而出現(xiàn)的以雙耳進行性高頻聽力下降為主要表現(xiàn)的慢性退行性疾病。研究表明，大于65歲的老人中，40%以上受老年性聾困擾［1，2］。隨著中國逐步進入老齡化社會，老年性聾因嚴重影響老年人的生活質量而受到社會關注。目前，老年性聾的發(fā)病機制并不十分清楚，但研究發(fā)現(xiàn)外周聽覺系統(tǒng)和聽覺中樞功能失調共同參與了老年性聾的發(fā)病，其中聽覺中樞神經細胞凋亡引起聽覺中樞功能障礙是老年性聾患者聽力下降、語言理解能力降低的主要原因之一［1，3］。

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）是一類抑制細胞凋亡的內源性抑制蛋白。Lois Miler實驗室成員最早在桿狀病毒體內發(fā)現(xiàn)一組能抑制被感染細胞發(fā)生凋亡的蛋白，并將其命名為IAP蛋白［4］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，與IAP蛋白具有同源性的蛋白在哺乳動物、昆蟲、細菌等許多物種體內普遍表達。迄今為止，研究者們發(fā)現(xiàn)人體內IAP家族共包含8個成員，其中X染色體連鎖凋亡抑制蛋白 （X－linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）結構最典型、抗細胞凋亡效應最明顯、功能最全面，被認為是IAP家族中抑制細胞凋亡能力最強的成員。

明確XIAP對老年性聾聽皮層相關細胞的抗凋亡作用，對臨床治療老年性聾、提高老年人生活質量具有重要意義。本文就腺病毒介導外源性XIAP高表達抑制聽皮層GABA能神經元凋亡與老年性聾的相關性研究進展作一綜述。

1 XIAP的分子結構及作用機制

XIAP基因位于Xq24－25，能表達含497個氨基酸、3個BIR結構域、1個RING結構域、相對分子量約為57kDa的 XIAP蛋白［5］。BIR結構域包含 BIR1、BIR2、BIR3三部分。目前，BIR1區(qū)的結構及作用機制尚不清楚，但已明確其能協(xié)同BIR2區(qū)抑制caspase－3和caspase－7［6］。BIR2區(qū)包含3個反向平行β片層、4個α螺旋、3個高保守半胱氨酸和1個組氨酸，每個BIR2區(qū)能螯合一個鋅原子。在BIR1區(qū)的協(xié)同作用下，BIR2區(qū)能與caspase－3和caspase－7結合并抑制其活性［7］，通過線粒體、內質網(wǎng)和細胞膜三條途徑共同抑制細胞凋亡。BIR3區(qū)能直接與caspase－9結合形成異源二聚體，使caspsae－9喪失活性，從而終止caspase途徑、抑制細胞凋亡［8］。由此可見，BIR結構域是抑制細胞凋亡的重要結合位點。RING結構域是位于XIAP C端的鋅指結構域，具有IAP鋅指結構的共性，能通過自身泛素化實現(xiàn)自身及結合蛋白的降解，協(xié)助其他抑制劑共同抑制細胞凋亡，是XIAP抗凋亡的重要結構。XIAP在人體正常組織中廣泛表達，除外周血淋巴細胞外的所有組織均表達。此外，XIAP在許多病理組織甚至腫瘤組織中也有表達，且其表達量與疾病預后密切相關。XIAP分布的廣泛性及其抑制細胞凋亡的特殊性使其成為近幾年來研究者們研究的熱點。

細胞凋亡是一種特殊的死亡方式，是在基因調控下的主動死亡過程，與凋亡過程中酶的參與密切相關。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件。目前發(fā)現(xiàn)，Caspase家族至少包含14個成員，其中caspase－9是線粒體中caspase途徑的起始因子，caspase－3和caspase－7是下游的執(zhí)行者。XIAP中BIR3結構域能直接與csapase－9結合，使caspase－9保持單體形式，抑制caspase下游級聯(lián)反應，從而抑制相關活性蛋白的水解并抑制細胞的凋亡和損傷。Caspase－3是caspase級聯(lián)反應的關鍵酶，細胞凋亡途徑的必經之路［9］。XIAP中BIR2區(qū)與caspase－3結合并抑制其激活，與caspase－7結合、抑制其活性并協(xié)同抑制caspase－3活性，從而完全終止caspase下游的級聯(lián)反應。因此，XIAP的BIR結構域能通過抑制caspase途徑的起始位點和共同途徑兩方面抑制細胞凋亡，是XIAP抑制細胞凋亡的重要機制之一。

目前研究表明［10］，XIAP不僅通過caspase級聯(lián)反應途徑抑制細胞凋亡，還可經核因子－κB（nuclear factor－kgene binging，NF－κB）途徑抑制細胞的凋亡。XIAP通過泛素化連接酶激活NF－κB經典途徑，促進NF－κB抑制劑的凋亡。同時，NF－κB能通過正反饋作用調節(jié)XIAP促進其表達上調。XIAP中RING結構域具有泛素化連接酶活性，因此，對其進行抑制即能通過抑制NF－κB途徑以達到抑制細胞凋亡的目的。有研究表明［11］，XIAP還能通過抑制c－Jun氨基端激酶（c－Jun N－terminal binases，JNK）的激活抑制其促細胞凋亡作用。

2 XIAP抑制老年性聾聽皮層GABA能神經元凋亡效應

2.1 聽皮層GABA神經元凋亡是聽皮層功能紊亂致老年性聾的重要原因之一

老年性聾在老年人群中普遍存在，配戴助聽器雖然解除了部分老年性聾患者的困擾，但其作為聽力輔助設備，不能替代中樞神經系統(tǒng)對聽覺信號傳遞、分析和加工的作用。研究發(fā)現(xiàn)［12，13］，老年性動物模型聽皮層capase－3表達明顯升高、神經凋亡速率增加，證明聽覺通路神經元的退行性病變及相關細胞的凋亡導致聽覺中樞的機能減退是老年性聾的主要病理變化之一。

聽皮層神經元可分為興奮性神經元和抑制性神經元。肖伯奎等［14］檢測大鼠聽皮層最常見的興奮性氨基酸類神經遞質和抑制性氨基酸神經遞質含量時發(fā)現(xiàn)，聽皮層興奮性神經遞質谷氨酸（Glu）的含量較高，而抑制性神經遞質γ－氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）的含量均較低，提示聽皮層神經元的反應以興奮性效應為主，抑制性效應為輔，當聽皮層損傷后，因神經元的去抑制作用，導致神經元的興奮性明顯增加。GABA和Gly為大腦皮層最典型的抑制性神經遞質，聽皮層GABA含量遠遠大于Gly含量。由此推測，GABA能神經元的凋亡可能是老年性聾的重要機制。Larry［15］研究年輕及老年大鼠聽皮層神經元差異時證實，隨著年齡的改變，聽皮層功能及神經化學遞質發(fā)生變化，最突出的變化是GABA能神經遞質明顯減少，進一步證明，聽皮層GABA能神經元的凋亡是導致聽覺中樞功能障礙的重要原因，是老年性聾患者聽力及語言理解能力降低的主要機制之一。

2.2 XIAP在老年性聾聽皮層GABA能神經元表達的研究進展

在聽力學領域，很多學者在體外研究中已經證實XIAP能有效抑制藥物、年齡、創(chuàng)傷等因素引起聽覺相關器官細胞凋亡。Wang等［16］將攜帶有6－Myc標記的人XIAP基因轉入2月齡和14月齡C57BL／6J小鼠體內構建轉基因動物模型，并以此為實驗組動物進行聽性腦干反應（ABR）測試、耳蝸毛細胞圖分析、Western－blot分析和毛細胞數(shù)據(jù)分析及計算，結果顯示，轉基因組小鼠聽力損失明顯減輕，尤其是高頻聽力和耳蝸內源性XIAP表達量明顯優(yōu)于非轉基因組，而聽毛細胞凋亡數(shù)目明顯減少；實驗還發(fā)現(xiàn)，轉基因動物耳蝸XIAP高表達，但大腦皮層聽覺中樞XIAP表達水平沒有明顯變化，證明內源性XIAP的高表達通過抑制耳蝸毛細胞的凋亡抑制老年性聾的發(fā)展。

大量研究致力于內源性XIAP表達與局部聽覺器官形態(tài)學和功能變化的相關性研究，忽略了外源性XIAP高表達對大腦皮層聽覺中樞神經元細胞形態(tài)學和功能變化的影響。探索外源性XIAP在聽皮層高表達與聽力相關疾病發(fā)生發(fā)展的內在聯(lián)系，可能是研究老年性聾的新途徑，對全面認識、研究和治療聽覺疾病具有重要的作用。李洪波等［17，18］首次對大腦皮層聽覺中樞XIAP和caspase－3表達量與老年性聾的相關性進行了研究，實驗以15只2月齡（青年組）和15只10月齡（老年組）C57BL／6J小鼠為動物模型，采用ABR、末端轉移酶介導的原位缺口末端標記染色法（TUNEL）及免疫組織化學法（SP法）檢測實驗動物反應閾、聽覺皮層神經細胞凋亡量及聽覺皮層神經細胞中XIAP、caspase－3表達量。結果顯示，老年組小鼠ABR反應閾、凋亡的神經細胞數(shù)及caspase－3表達量明顯高于2月齡青年組小鼠，但XIAP表達量結果剛好相反，且聽覺皮層神經細胞中caspase－3表達量與XIAP表達量及ABR反應閾負相關。實驗揭示了聽覺皮層XIAP及caspase－3表達水平與老年性聾密切相關，XIAP可能通過caspase－3途徑抑制聽皮層神經細胞凋亡從而達到改善老年性聾患者語言識別能力的目的。

目前國內外尚無關于XIAP抑制聽皮層GABA能神經元凋亡與老年性聾相關性的報道。由此啟示，構建能穩(wěn)定表達外源性XIAP的重組腺病毒載體系統(tǒng)轉染老年性聾聽覺皮層可能抑制聽皮層GABA能神經元凋亡，從而抑制老年性聾的發(fā)生、發(fā)展，對增強老年性聾患者的聽力及對語言的理解能力具有現(xiàn)實意義。明確外源性XIAP抑制聽皮層GABA能神經元凋亡作用是研究老年性聾的新方向，為臨床尋找老年性聾的治療方法指明了新道路。

3 腺病毒介導XIAP（Ad－XIAP）在聽皮層GABA能神經元高表達與老年性聾相關性的研究展望

第三代腺病毒載體是目前實驗室常用載體系統(tǒng)之一，其宿主廣泛、滴度較高、安全性好，在基因治療相關疾病［19］和疫苗載體［20，21］研究領域中備受青睞。隨著腺病毒載體系統(tǒng)在實驗及臨床研究的廣泛應用，第三代腺病毒載體系統(tǒng)靶向性不明確、具有免疫原性和細胞毒性等缺點不容忽視。針對這些問題，研究者們［22，23］通過改良腺病毒載體系統(tǒng)局部結構、改變腺病毒轉染方法及免疫抑制劑暫時降低宿主免疫力等方法，以提高腺病毒靶向性、降低細胞毒性。

目前關于XIAP在老年性聾聽皮層表達的研究剛剛展開，雖然國內外尚無關于重組腺病毒介導XIAP（Ad－XIAP）在聽皮層GABA能神經元高表達與老年性聾相關性的研究報道，但構建重組腺病毒載體轉染顱腦神經細胞實驗早已廣泛開展，技術已經非常成熟。Hermann等［24］對C57BL／6J小鼠進行顱內重組腺病毒注射研究基因治療對大腦中動脈損傷的保護作用；同年該作者［25］再次對大鼠運動感覺皮層立體定向注射重組腺病毒載體，研究神經膠質細胞生長因子對大鼠運動感覺皮層凍傷的治療作用。盡管尚未見到Ad－XIAP轉染聽皮層的實驗報道，但重組腺病毒轉染顱腦神經細胞實驗的廣泛開展使Ad－XIAP轉染聽皮層GABA能神經元實驗具備了實踐的可行性。有研究［26］表明，腺病毒攜帶XIAP轉染大鼠海馬部位可通過抑制caspase－3途徑保護大鼠CAI海馬神經元因短暫性腦缺血引起的死亡；Zadro－Lamoureux等［27］通過構建攜帶XIAP的腺病毒載體轉染實驗動物后，發(fā)現(xiàn)其能保護視網(wǎng)膜外核層神經細胞產生神經保護作用使其免于凋亡。越來越多的研究者［28～30］開展了重組腺病毒轉染皮層神經細胞的實驗，從側面證明重組腺病毒載體攜帶外源性XIAP（Ad－XIAP）轉染大腦聽皮層GABA能神經元具有理論可行性。

綜上所述，Ad－XIAP轉染聽皮層神經細胞介導XIAP在聽皮層高表達，可通過抑制caspase－3通路有效抑制聽皮層GABA能神經元凋亡，從而改善老年性聾患者癥狀。因此，外源性XIAP在聽覺皮層的高表達抑制GABA能神經元凋亡可能是研究老年性聾發(fā)病機制的新思路，是臨床治療老年性聾的新方法，對老年性聾的預防和診治具有啟發(fā)和引導作用。推測Ad－XIAP對臨床治療老年性聾具有較高的潛在應用價值，必將成為一種新型的治療老年性聾的途徑。

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