核苷(酸)類(lèi)藥治療慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因耐藥的變異分析

徐玲娟，盛秀勝

核苷類(lèi)似物（NA）抗HBV在臨床上已得到廣泛應(yīng)用，但相應(yīng)的HBV耐藥問(wèn)題也逐漸浮現(xiàn)出來(lái)，并成為制約其抗病毒療效的首要因素[1-2]。由于HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶沒(méi)有校對(duì)功能，NA相關(guān)的HBV耐藥變異多發(fā)生在多聚酶基因（P）的逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（RT）。為此，本研究分析長(zhǎng)期核苷(酸)類(lèi)藥治療慢性乙型肝炎患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因變異情況，為臨床合理用藥及進(jìn)一步開(kāi)展耐藥機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病例及標(biāo)本來(lái)源 收集2006年1月-2010年3月在金華市中醫(yī)院就診的長(zhǎng)期核苷（酸）類(lèi)藥物治療的慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本163份，男性標(biāo)本125份，女性標(biāo)本38份，患者年齡18～73歲，平均（42±12）歲。其中單用拉米夫定（1amivudine，LAM）66例，阿德福韋酯（adefovir dipivoxil，ADV）62例，患者口服拉米夫定（0.1 g/d）療程12～36個(gè)月，阿德福韋酯（10 mg/d）療程24～48個(gè)月。LAM和ADV序貫治療19例，LAM與ADV聯(lián)合治療16例，療程12～36個(gè)月。序貫治療或聯(lián)合治療均在患者接受單劑LAM治療后出現(xiàn)血清HBV DNA反跳至104拷貝/mL以上及（或）生化指標(biāo)明顯改變時(shí)使用。所有標(biāo)本-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 HBV聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因全序列分析 采用QIAamp DNA試劑盒（購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司）從血清中提取HBV DNA。用劉寶明等[3]報(bào)道的半巢式PCR擴(kuò)增HBV全長(zhǎng)RT區(qū)，將PCR產(chǎn)物直接送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。用DNAStar5.0、Vector NTI 13.0等軟件分析HBV RT區(qū)核苷酸及氨基酸序列，并分別將其與先前報(bào)道的突變序列相應(yīng)位點(diǎn)上的氨基酸比對(duì)，篩查分析RT區(qū)6個(gè)主要的耐藥變異位點(diǎn)rtl73、rtl80、rtl81、rt204、rt207和rt236氨基酸耐藥變異[4]。

1.3 HBV基因型檢測(cè) 由于HBV RT區(qū)與編碼HBsAg的S基因區(qū)相互重疊，其核苷酸序列也可決定HBV基因型。為此本研究在RT區(qū)基因分析基礎(chǔ)上，應(yīng)用NCBI病毒基因分型工具及MEGA4.0軟件對(duì)HBV的S基因區(qū)核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定HBV基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 數(shù)據(jù)采用SPSSl5．0軟件分析，組間比較用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HBV全長(zhǎng)RT區(qū)基因耐藥位點(diǎn)分析 采用半巢式PCR擴(kuò)增HBV聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)基因，并行測(cè)序，結(jié)果分析顯示，163份慢性乙型肝炎患者血清標(biāo)本中有64份（占39.26%）發(fā)現(xiàn)了已知耐藥位點(diǎn)變異。LAM治療組耐藥性變異比例高于ADV治療組，其中66例單用LAM患者標(biāo)本有26例（占39.40%），62例單用ADV患者標(biāo)本有8例（占12.90%）發(fā)現(xiàn)已知耐藥位點(diǎn)變異。由于LAM和ADV序貫治療或聯(lián)合治療是在患者接受單劑LAM治療失敗后使用，突變位點(diǎn)檢測(cè)陽(yáng)性率明顯升高。19例LAM和ADV序貫治療標(biāo)本有16例（占84.21%）發(fā)現(xiàn)耐藥位點(diǎn)變異，16例LAM治療后加用ADV治療標(biāo)本有14例（占87.50%）發(fā)現(xiàn)耐藥位點(diǎn)變異。如表1-4所示，由于治療藥物不同，其耐藥位點(diǎn)及發(fā)生率也不相同。單用LAM組L180M、M204V/I是最常見(jiàn)的變異，偶有V173L、A18lV、A18lT、A181S及V207I氨基酸位點(diǎn)變異存在，未見(jiàn)N236T變異。與單用LAM組明顯不同，單用ADV組主要的變異是N236T和A181T/V變異。LAM和ADV序貫治療組除外LAM耐藥變異特征外，19例序貫治療患者出現(xiàn)了5例（占26.32%）ADV耐藥變異特征：2例N236T+A181V/T、1例N236T、2例A181V，而LAM治療后加用ADV組未見(jiàn)N236T及A181V/T變異，只是存在較高比例的V173L變異。

表1 單用LAM慢性乙肝患者HBV RT區(qū)氨基酸耐藥性變異及基因型分析

表2 單用ADV慢性乙肝患者HBV RT區(qū)氨基酸耐藥性變異及基因型分析

表3 LAM和ADV序貫治療慢性乙肝患者HBV RT區(qū)氨基酸耐藥性變異及基因型分析

表4 先用LAM后聯(lián)合ADV治療慢性乙肝患者HBV RT區(qū)氨基酸耐藥性變異及基因型分析

2.2 耐藥變異與HBV基因型相關(guān)性分析 如表1-4所示，64例存在RT基因耐藥位點(diǎn)的患者中，C基因型HBV感染者為19例（占29.69%），B基因型為45例（占70.31%），未檢測(cè)到其他基因型。B基因型和C基因型比例在單用LAM組、單用ADV組、LAM和ADV序貫治療組和LAM治療后加用ADV組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=0.421，P＞0.05），B基因型在上述4組的比例分別為69.23%、62.50%、75.00%和71.43%。

3 討論

LAM、阿德福韋酯等核苷（酸）類(lèi)似物是目前公認(rèn)有效的抗乙型肝炎病毒治療的藥物。這類(lèi)藥物在體內(nèi)與HBV DNA聚合酶底物——三磷酸脫氧核苷競(jìng)爭(zhēng)，抑制HBV DNA的正常逆轉(zhuǎn)錄作用，也可直接整合到病毒DNA鏈中，形成終止子，使HBV DNA鏈停止復(fù)制，從而發(fā)揮較強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制的作用。在長(zhǎng)期抗病毒治療過(guò)程中，HBV出現(xiàn)耐藥變異難以避免[4-5]。由于HBV復(fù)制能力強(qiáng)，且其逆轉(zhuǎn)錄酶缺少校正活性，導(dǎo)致HBV治療前就存在自發(fā)性變異，病毒耐藥變異的過(guò)程就是藥物對(duì)病毒變異的選擇過(guò)程[6]。我們對(duì)163例長(zhǎng)期服用核苷（酸）類(lèi)治療的慢性乙肝患者的RT基因區(qū)的變異進(jìn)行了檢測(cè)分析， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單用LAM 1年以上的慢性乙肝患者RT基因區(qū)的變異率達(dá)39.40%，單用ADV 2年以上的慢性乙肝患者RT基因區(qū)的變異率僅達(dá)12.90%，提示ADV耐藥的發(fā)生率遠(yuǎn)低于LAM。

目前已發(fā)現(xiàn)與LAM耐藥相關(guān)的主要變異位點(diǎn)是M204V/I（YMDD變異）[4]。M204V/I變異株的復(fù)制能力明顯下降，其他常與YMDD變異同時(shí)出現(xiàn)的變異如M204V/I、L180M、V173L、A181T、V207I，一定程度上能夠恢復(fù)YMDD變異病毒的復(fù)制能力[7-8]。本研究發(fā)現(xiàn)，用LAM組存在5例未有M204V/I變異，而存在L180M、A18lV+V207I、V173L+L180M+V207I及A181S氨基酸位點(diǎn)變異。提示，出現(xiàn)這些位點(diǎn)變異的病毒對(duì)藥物的敏感性并無(wú)太大影響，但應(yīng)具更強(qiáng)的復(fù)制能力。由于病例數(shù)較少，還需進(jìn)一步研究。與既往的研究結(jié)果一致，ADV主要耐藥相關(guān)變異為N236T、A181V/T[9]。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在LAM治療耐藥后合用ADV的患者中，未見(jiàn)ADV耐藥相關(guān)位點(diǎn)變異（18l及236位），而在LAM和ADV序貫治療的16例患者中，出現(xiàn)ADV相關(guān)位點(diǎn)變異5例，表明序貫治療后出現(xiàn)LAM和ADV多重耐藥的概率明顯增加[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，LAM治療后加用ADV治療發(fā)現(xiàn)耐藥位點(diǎn)變異頻率（87.5%）與序貫治療（84.12%）相當(dāng)，提示，不管是加藥還是換藥，均無(wú)法逆轉(zhuǎn)原先已經(jīng)存在的LAM治療后耐藥特征。本結(jié)果為臨床合理用藥及進(jìn)一步開(kāi)展耐藥機(jī)制研究提供了依據(jù)。

病毒的基因型反映了HBV自然感染發(fā)生變異的特點(diǎn)。基因型分布有地域性，我國(guó)以B、C型為主，還有少量A、D型[11-12]。本研究結(jié)果顯示，64例存在RT基因耐藥位點(diǎn)的患者均為B、C型，其中C基因型HBV感染者占29.69%，B基因型占70.31%。王義光等[13]研究顯示，87例接受LAM治療的患者以B基因型為主，但發(fā)生耐藥變異率較高的是C型。本研究分析單用LAM、單用ADV、LAM和ADV序貫治療及LAM與ADV聯(lián)合治療患者中發(fā)生RT基因耐藥位點(diǎn)改變的HBV基因型比例，結(jié)果顯示各組基因型比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示長(zhǎng)期核苷類(lèi)似物治療中HBV耐藥變異的發(fā)生與基因型無(wú)關(guān)[14-15]。

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