柱前衍生HPLC分析銀耳多糖的單糖組成

顏 軍， 侯賢燈， 徐開來

（1．四川大學化學學院，四川 成都 610064；2．成都大學中藥化學實驗室，四川 成都 610106）

柱前衍生HPLC分析銀耳多糖的單糖組成

顏 軍1，2， 侯賢燈1， 徐開來1

（1．四川大學化學學院，四川 成都 610064；2．成都大學中藥化學實驗室，四川 成都 610106）

建立1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜法分離檢測5種單糖的方法。根據(jù)單糖PMP衍生物的峰面積大小，對衍生化反應中反應時間、PMP與NaOH的量、中和溫度和鹽酸用量進行了考察，從而得到較佳的衍生化樣品制備條件。以20mmol·L-1磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動相，考察了pH值和乙腈體積分數(shù)對糖衍生物分離的影響，確定最佳pH值為6.72，最佳乙腈體積分數(shù)為18%，并將該方法應用于銀耳酸性多糖的單糖組成的測定。

單糖；多糖；高效液相色譜；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

1 引 言

銀耳在我國已有悠久的藥用和食用歷史。近年來，對銀耳的化學成分及藥理活性所進行的研究和大量的現(xiàn)代藥理證明，多數(shù)藥理活性都與銀耳多糖有關，特別是酸性銀耳多糖。成都大學中藥化學實驗室對銀耳多糖進行了分離純化，得到了酸性銀耳多糖純品TPP2[1]。而多糖的單糖組成測定則是控制多糖質(zhì)量標準和提供多糖基本信息的重要環(huán)節(jié)。

由于單糖分子的多樣性，關于糖的分析方法仍在不斷發(fā)展。單糖組分的色譜分離測定方法目前主要有高效液相色譜法（HPLC）[2-3]、氣相色譜法（GC）[4-5]、薄層色譜法（TLC）[6]等。采用GC測定糖類，由于糖本身沒有足夠的揮發(fā)性，所以必須在氣相色譜分析之前預先轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性較強的衍生物，分析過程較為復雜。另外，在糖衍生物的制備過程中，又常會產(chǎn)生衍生物的異構體，在色譜分析時每種糖可能會產(chǎn)生幾個峰，這往往影響組分的分離和定量測定。

采用HPLC分析單糖組成的難點在于單糖本身沒有紫外吸收，人們常將多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法分離和檢測，以改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度。在眾多的衍生化方法中，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化高效液相色譜法因反應條件較溫和、產(chǎn)物無立體異構、紫外檢測靈敏度較高，得到較為廣泛的應用[7]。該文選取PMP作為柱前衍生化試劑，用高效液相色譜法分離檢測5種單糖，通過對衍生化條件的考察以及色譜分離條件的選取，建立了銀耳多糖的單糖組成分離測定方法，具有較好的實用意義。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

日立LC-2000高效液相色譜儀，包括L-2130二元泵，L-2450 DAD檢測器。

衍生化試劑：1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），純度 99%（美國 Acros Organics公司）；乙腈（色譜純，成都科龍化工試劑廠）；鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司）。

單糖標準品：葡萄糖（Glc，99%）、甘露糖（Man，99%）、半乳糖（Gal，≥99%）、鼠李糖（Rham，≥99%）、木糖（Xyl，98%）均購于上?；瘜W試劑公司；超純水；其他試劑均為分析純。

銀耳酸性多糖TPP2由成都大學中藥化學實驗室自制[1]。

2.2 混合單糖標樣的衍生

分別取200μL的混合單糖標準液（各單糖摩爾濃度均為 1mmol·L-1）與 120μL 的 0.25mol·L-1NaOH溶液，加120μL 0.50mol/L的PMP甲醇溶液，置于5mL的具塞試管中漩渦混勻；在70℃水浴中反應90min；取出置冷水浴中 10min；加 120μL 0.30mol·L-1的HCl中和；再加2mL的氯仿，振搖，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45μm微孔膜過濾后供HPLC進樣分析。

2.3 樣品制備

吸取1mL質(zhì)量濃度為4～5 g·L-1的多糖樣品溶液于安瓿瓶中，加入100μL的2.00mol·L-1H2SO4，充N2封管，110℃烘箱中水解2h[3]。冷卻后，NaOH溶液中和至中性，然后按“2.2”法進行衍生化反應。

2.4 色譜條件

色譜柱：大連江申 C18，250mm×4.6mm，5μm；流動相：20mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν 為 82∶18）；柱溫：30℃；檢測波長：250 nm；流速：1mL·min-1；進樣體積：20μL。

3 結果與討論

3.1 流動相pH及乙腈體積分數(shù)對分離的影響

反相分離單糖PMP衍生物時，常以緩沖液-乙腈為流動相。該文首先考察了乙腈比例（15%、18%、21%）對上述5種單糖在C18柱上的保留值及分離效果的影響。結果顯示，15%乙腈時半乳糖和木糖衍生物出峰太遲且峰較寬；21%乙腈時甘露糖衍生物峰與PMP峰重疊無法分開，同時半乳糖和木糖衍生物峰的分離也不佳；而乙腈的體積分數(shù)為18%時分離較好（見圖1）。此外，緩沖液的pH對糖衍生物的分離也是一重要的影響因素。實驗進一步考察了醋酸緩沖液（pH 5.43）和磷酸緩沖液（pH 6.72）對各種糖衍生物的保留值及分離效果的影響。結果表明，采用pH為6.72的磷酸緩沖液時分離效果最佳，分析時間較短，出峰間距較均勻。因此，確定流動相為磷酸鹽緩沖液（pH 6.72）-乙腈（ν∶ν 為 82∶18）。該文方法不需梯度洗脫即可同時實現(xiàn)5種單糖衍生物的分離，且分離效果較好。

圖1 衍生樣品色譜圖

3.2 PMP與NaOH的量對衍生化反應的影響

在衍生化反應中，為了保證單糖完全反應，一般采用PMP的量大大超過理論所需量。實驗中，取200μL的混合單糖標準液（各單糖濃度均為1mmol·L-1）加120μL 0.50mol·L-1的PMP甲醇溶液，控制PMP的量為混合單糖總量的60倍；然后分別加入30μL，60μL，90μL，120μL，200μL 的 0.25mol·L-1NaOH溶液，按“2.2”條件制備樣品。色譜分析結果表明，NaOH溶液加入量為120μL時各種糖的PMP衍生產(chǎn)物的峰面積均為最大值，故確定NaOH溶液加入量為 120μL。

3.3 衍生化反應時間的選擇

在其他條件（如“2.2”所述）相同情況下，將混合單糖標樣分別采用 30min，60min，90min，120min 的反應時間進行衍生化反應，考察衍生化糖峰的峰面積大小變化。結果表明，反應時間為90min時，各種糖的PMP衍生產(chǎn)物的峰面積均為最大值，故衍生化反應時間選為90min。

3.4 中和溫度的影響

由于在衍生化反應中PMP大大過量且在色譜分離中有一定的影響[2]，所以衍生反應完成后，需要用氯仿萃取去除過量的PMP。但糖的PMP衍生產(chǎn)物的化學結構中含有堿性基團，在pH值較高時不解離，因而易被氯仿萃取而損失，所以在萃取前應中和反應體系中的堿。在文獻[7]中一般都采用冷卻至室溫。在實驗進行中發(fā)現(xiàn)室溫是一個很不確定的溫度，比如夏季與冬季的室溫差在20℃以上，這個差異導致了中和反應衍生化產(chǎn)物的不穩(wěn)定，對樣品分析和含量測定產(chǎn)生了很大的影響。因此，對靜置冷卻至室溫（體系實測溫度為32℃）與用冷水浴冷卻10min（體系實測溫度為12℃）兩個中和溫度條件進行了比較。實驗結果表明，冷水浴冷卻10min后中和的溫度條件的色譜分析效果非常好，而室溫冷卻的色譜分析效果很差。主要表現(xiàn)在單糖衍生物峰面積大幅減小和死時間附近的有色物質(zhì)峰面積大大增加。這是因為單糖衍生物不穩(wěn)定，在較高溫度條件下中和，由于酸的影響產(chǎn)生了部分衍生化不完全產(chǎn)物，導致單糖衍生物峰面積減小。這部分物質(zhì)由于極性較強，所以不保留或保留較弱，峰出現(xiàn)在死時間附近。

3.5 酸度對萃取效果的影響

實驗中考察比較了不同體積（120μL，150μL，180μL，210μL）的HCl（0.3mol·L-1）中和后的萃取效果。結果表明，使用120μL的鹽酸中和即可，此時體系的pH值為5.64。萃取后大多數(shù)單糖PMP衍生物的峰面積較大，且5種糖衍生物的總的峰面積最大。實驗結果表明，pH值（鹽酸用量）對糖的PMP衍生物在萃取過程中的損失有一定的影響。pH值＞7，不利于單糖PMP衍生物的解離，因而在氯仿中有一定的溶解度，萃取中的損失較顯著。pH值太低（＜4）也會增大單糖衍生物的損失，這是由于在酸性條件下衍生產(chǎn)物不太穩(wěn)定所致。因此，應合理調(diào)節(jié)體系的pH值在5～6范圍內(nèi)。

3.6 萃取次數(shù)的影響

實驗中采用2mL的氯仿進行萃取，對萃取次數(shù)進行了比較。結果表明，氯仿對PMP的萃取率較高，3次萃取后即可去掉99.0%的PMP。而對單糖衍生物的萃取影響不大，3次萃取后單糖衍生物的損失為3.50%。因此，確定萃取次數(shù)為3次。

3.7 檢測線性及檢出限

將5種單糖配制成一系列不同濃度的混合標樣，分別按“2.2”衍生化，并在“2.4”所述條件下進樣檢測，以測得的各種糖的峰面積對相應濃度作工作曲線，結果見表1。

3.8 銀耳多糖樣品的單糖組成分析和方法重復性實驗

在單糖組成分析中由于只需求得單糖間的摩爾比，并不需要知道各單糖的具體量。所以，在樣品的分析中采用面積歸一法計算。由于甘露糖在TPP2水解液中的濃度較大，為滿足線性范圍，采用稀釋10倍后進行單獨測定。根據(jù)分析和計算方法，求得TPP2中各單糖的組成摩爾比為甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖=77∶10∶3∶1∶15。甘露糖的 RSD （n=6）為2.13%；鼠李糖的RSD（n=6）為0.56%；葡萄糖的RSD（n=6）為 1.08%；半乳糖的 RSD（n=6）為 3.81%；木糖的 RSD（n=6）為 0.72%。

表1 銀耳多糖TPP2的組成測定結果

4 結束語

對PMP衍生化方法進行了較系統(tǒng)深入的優(yōu)化研究，考察了PMP與NaOH的用量、反應時間對反應的影響，確定了中和時反應體系的溫度和鹽酸用量。研究表明，反應體系在冷水?。?2℃）中冷卻10min后，中和至微酸（pH 5.64）再進行萃取等操作，才會獲得較好的色譜分離效果。建立了18%乙腈-磷酸鹽緩沖液（20mmol·L-1、pH 6.72）為流動相等度 HPLC分析5種單糖的定性定量方法。利用該方法對TPP2的單糖組成進行了測定，求得TPP2中甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖的摩爾比為 77∶10∶3∶1∶15。與文獻[2]比較，該方法的檢測靈敏度大大提高，并彌補了不能分離檢測葡萄糖和半乳糖的不足，可望推廣用于其他多糖的單糖組成研究。

[1]顏 軍，徐光域，郭曉強，等.銀耳粗多糖的純化及抗氧化活性研究[J].食品科學，2005，26（9）：169-172.

[2]顏 軍，郭曉強，鄔曉勇，等.非衍生化HPLC法分析銀耳多糖中單糖組成的初步研究[J].食品科學，2007，28（7）：446-449.

[3]Meyer A，Raba C，F(xiàn)ischer K.Ion-pair RP-HPLC determination of sugars，amino sugars,and uronic acids after derivatization with p-aminobenzoic acid[J].Anal.Chem.，2001（73）：2377-2382.

[4]張艷萍，俞遠志，張 虹.氣相色譜分析生地黃多糖的單糖組成及其含量[J].中國中藥雜志，2009，34（4）：419-422.

[5]張 威，何紅波，張 明，等.糖腈乙酰酯衍生氣相色譜法測定土壤水解性單糖[J].土壤通報，2008，39（4）：913-916.

[6]顏 軍，郭曉強，李曉光，等.TLC快速分析多糖的單糖組成[J].食品科學，2006，27（12）：603-607.

[7]馬定遠，陳 君，李 萍，等.柱前衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖組成[J].分析化學，2002，30（6）：702-705.

Analysis of monosaccharide com positions in tremella polysaccharides by pre-column derivatization high performance liquid chromatography

YAN Jun1，2，HOU Xian-deng1，XU Kai-lai1
（1.College of Chemistry，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2.Laboratory for Chemistry of Traditional Chinese Medicine，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

A method of PMP pre-column derivatization high performance liquid chromatographic was established for analysis of five kind of monosaccharide.The optimum conditions of derivatization were determined by studying the quantity of PMP and sodium hydroxide，reaction time，reaction temperature and hydrochloric acid consumption during neutralization.Under the optimum mobile phase which was 18%acetonitrile-phosphate buffer（20mmol·L-1，pH 6.72），PMP derivatives can be separated successfully.This method was applied to monosaccharide compositions analysis of tremella polysaccharide（TPP2）.

monosaccharide；polysaccharide；HPLC；PMP

S567.3+4；TS247

A

1674-5124（2011）01-0044-03

2010-04-20；

2010-08-03

四川省中醫(yī)藥管理局科技專項資助項目（2008-01）

顏 軍（1971-），男，四川成都市人，高級實驗師，主要從事生物活性成分的分離與檢測工作。