飲料中腸桿菌科細(xì)菌污染情況分析*

王洋，周幗萍

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢，430023)

腸桿菌科微生物為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，需氧或兼性厭氧，廣泛分布于環(huán)境中。據(jù)細(xì)菌學(xué)新的分類，腸桿菌科包括腸道病原性和非病原性的埃希氏菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、變形菌屬(Proteus)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、致病桿菌屬(Xenorhabdus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)等41 個(gè)菌屬［1］。

由于其分布廣泛，能快速厭氧發(fā)酵糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，所以一旦污染到飲料產(chǎn)品中會(huì)迅速生長，導(dǎo)致發(fā)生漲罐、變酸、變味、混濁等現(xiàn)象。盡管該類細(xì)菌都是不耐熱的，但是實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有該科微生物的污染，特別是冷灌裝產(chǎn)品中很常見。現(xiàn)就近3年發(fā)生的5個(gè)案例中腸桿菌科細(xì)菌的污染情況進(jìn)行分析，希望對預(yù)防和排查類似污染起到參考作用。

1 材料與方法

1.1 樣品

2009－2011年數(shù)家飲料生產(chǎn)企業(yè)送檢的5種不同變質(zhì)樣品。案例1:2009年9月河南某企業(yè)送檢PET瓶裝綠茶樣品(冷灌裝);案例2:2010年8月湖北某企業(yè)送檢的利樂包裝復(fù)原乳飲料樣品(熱灌裝);案例3:2010年9月北京某企業(yè)PET瓶裝綠茶飲料(冷灌裝);案例4:2011年5月湖北省某企業(yè)送檢PET瓶裝奶茶樣品(冷灌裝);案例5:2011年4月湖北省某企業(yè)送檢PET瓶裝蜜橘飲料(冷灌裝)。

1.2 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA);孟加拉紅培養(yǎng)基(虎紅培養(yǎng)基);伊紅美蘭瓊脂(EMB)。

1.3 材料

PCR 主要試劑如:PCR Buffer、Mg2+、Taq酶和Goldview熒光染料為TaKaRa產(chǎn)品，OMEGA bio-tek PCR及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒。

1.4 儀器設(shè)備

英國 TECHNE TC-312 PCR儀;上海三申(YM50AI)全自動(dòng)滅菌鍋;蘇凈安泰SW-CJ-1FD無菌操作臺(tái);DYY8B型穩(wěn)壓電泳儀，北京市六一儀器廠;SYNGENE凝膠圖像分析系統(tǒng);上海安亭TGL-16C離心機(jī)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 樣品中微生物的檢測與計(jì)數(shù)［2］

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，在PCA培養(yǎng)基上進(jìn)行樣品中細(xì)菌總數(shù)的測定。在37℃培養(yǎng)1 d后計(jì)數(shù)，并進(jìn)行單菌落的分離和純化。

1.5.2 分離菌株的 16S rDNA［3］和rpoB序列分析［4－6］

菌裂解液的制備:挑取純化單菌落，加入裝有50 μL無菌去離子水的PCR管中，混勻，PCR儀上94℃保溫10 min裂解，12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入微量離心管內(nèi)，制成菌裂解液，4℃保存。

PCR體系和條件:50 μL PCR體系:Taq酶0.25μL;10x PCR Buffer 5 μL;Mg2+3 μL;2.5 mmol/L 的dNTP 4 μL;2 個(gè)10 mmol/L 引物各1 μL;菌裂解液模板 5 μL;無菌去離子水 33.75 μL。

16S rDNA通用引物27F-AGAGTTTGATCATGGCTCAG和804R-CTACCAGGGTATCTAATC;PCR條件為:94℃裂解5 min;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 60 s(27F-804R)，循環(huán)35 次;72℃ 7 min。

rpoB引物rpoB-F-CAGTTCCGCGTTGGCCT和rpoB-R-CCTGAACAACACGCTCGGA;PCR條件:94℃裂解 5 min;94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 70 s，循環(huán) 30次;72℃ 7 min。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，Goldview染色，凝膠成像分析儀觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

PCR產(chǎn)物的純化和測序:采用OMEGA bio-tek PCR及酶反應(yīng)產(chǎn)物純化試劑盒，按操作說明書純化PCR產(chǎn)物，送上海生工生物工程有限公司測序。

序列比對:在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST進(jìn)行BLASTN比對。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樣品的理化指標(biāo)

樣品均有均勻混濁、產(chǎn)氣、脹瓶/袋現(xiàn)象，pH值有所下降。微生物檢測指標(biāo)見表1。

表1 5個(gè)案例中變質(zhì)樣品的微生物指標(biāo)

2.2 污染菌的培養(yǎng)特性與顯微形態(tài)分析［7］

5個(gè)案例中共分離出11個(gè)菌株，具有相似的特征，即在EMB培養(yǎng)基上生長良好，24 h即可形成菌落，菌落淺粉色、紫色;在PCA培養(yǎng)基上生長迅速，24 h形成白色、黃色、微黃色，半透明、濕潤、光滑的小菌落。顯微觀察他們的形態(tài)為單個(gè)、分散的桿菌，長短不一，見圖1、圖2、圖3和圖4。

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

圖1 案例1中的污染菌

圖2 案例4中的污染菌(陰溝腸桿菌)

圖3 案例5中污染菌(陰溝腸桿菌)

圖4 案例5中的污染菌(陰溝腸桿菌)

5個(gè)案例中分離的主要污染菌11株經(jīng)過16S rDNA測序比對后，與腸桿菌科微生物序列相似度最高，Max Identity達(dá)99% ～100%，鑒定為腸桿菌科Enterobacteriaceae細(xì)菌。其中案例4中1個(gè)分離株和案例5中的2個(gè)分離株進(jìn)行了進(jìn)一步的rpoB基因PCR擴(kuò)增、測序、BLASTN序列分析，兩者都與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)細(xì)菌的rDNA序列相似性達(dá)99%，被進(jìn)一步鑒定為陰溝腸桿菌(E.cloacae)。

2.4 生產(chǎn)線排查結(jié)果

因?yàn)槟c桿菌科細(xì)菌不耐熱，所以它們在飲料工業(yè)中的污染來自于殺菌后的二次污染，而且食品工業(yè)中腸桿菌科污染源頭多數(shù)與水有關(guān)。結(jié)合微生物分析結(jié)果，對生產(chǎn)線排查發(fā)現(xiàn)，案例1的污染來自少量水(非無菌水)滲漏到無菌灌裝線的無菌空氣過濾器中，由無菌空氣將水中的細(xì)菌帶入成品中。案例2是因?yàn)闄C(jī)器老化，包裝的封口溫度過高，可能引起包裝出現(xiàn)細(xì)小裂隙，由冷卻水帶入成品。案例3中除了腸桿菌污染以外，還發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌和少量霉菌的污染。因?yàn)槊咕嘟M成為:枝孢霉、交鏈孢霉、青霉、毛霉等，和空氣中霉菌的菌相高度一致，推測污染源為空氣，通過更換空氣過濾器也解決了污染［8］。案例4發(fā)現(xiàn)，問題產(chǎn)品雖然檢測時(shí)氣密型正常，但是包材表面有劃傷，污染樣品中也分離到少量霉菌:曲霉和青霉為主。推測可能是灌裝時(shí)出現(xiàn)細(xì)小、短暫的裂隙，空氣污染導(dǎo)致的。案例5，是新灌裝生產(chǎn)線的部分灌裝頭存在不暢和滲漏導(dǎo)致污染。

3 結(jié)果與討論

目前16S rDNA序列比對已被廣泛用于細(xì)菌鑒定分類，但由于該基因的保守性，在某些物種如:腸桿菌科中不能準(zhǔn)確鑒定到種和屬［4］。但是腸桿菌科中包括沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、腸桿菌屬、克羅諾屬(Cronobactergen.nov.，原阪崎腸桿菌Enterobacter sakazakii)、變形菌屬和埃希氏屬等有許多常見的食源性致病菌，對食品安全影響很大，實(shí)際工作中希望能進(jìn)一步鑒定。此時(shí)，結(jié)合其他持家基因的分析就非常重要，如:rpoB或dnaJ。

編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因目前已成為系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)菌鑒定的核心基因候選者，尤其是在研究親緣關(guān)系很近的菌株時(shí)。與16S rDNA基因分析相結(jié)合，rpoB基因序列分析有助于定義細(xì)菌的新種，完善細(xì)菌群落分析，同時(shí)可以監(jiān)控利福平抗性突變［4－6］。通過16S rDNA序列分析，案例4中1個(gè)分離株和案例5中分離的2個(gè)菌株是腸桿菌科細(xì)菌，再通過rpoB序列分析就準(zhǔn)確鑒定到種—陰溝腸桿菌(E.cloacae)。

陰溝腸桿菌屬腸桿菌屬，為需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。腸桿菌屬腸桿菌是最常見的環(huán)境菌群，但不是腸道常居菌群，是條件致病菌。陰溝腸桿菌是最常見的條件致病菌之一，?？蓮呐R床標(biāo)本中分離到，如泌尿道、呼吸道和傷口感染有關(guān)，陰溝腸桿菌導(dǎo)致食物中毒也曾有報(bào)道［9－11］。

腸桿菌科微生物廣泛存在于水、土壤等外界環(huán)境中，因此在飲料加工中很容易被污染，因其不耐熱，所以在飲料滅菌時(shí)無法存活，成品中檢出腸桿菌科微生物，來自于滅菌后加工過程的二次污染［10］。腸桿菌屬細(xì)菌經(jīng)常會(huì)污染到食品中，在小作坊式生產(chǎn)過程中，一般是來自與操作工人手的直接接觸，特別是在從業(yè)人員未做好必要的個(gè)人衛(wèi)生時(shí)。考慮到大企業(yè)的正常飲料生產(chǎn)中一般操作工人不會(huì)與物料發(fā)生直接接觸，水源的污染是可能性最大的污染途徑。這5個(gè)案例中3個(gè)的污染源頭都是水，只有案例3和4是個(gè)例外，污染菌來自車間內(nèi)濕潤的空氣。

近來由于無菌冷灌裝產(chǎn)品的包材成本低、顏色淺、風(fēng)味好、營養(yǎng)物質(zhì)損失少，所以受到飲料行業(yè)的青睞。但是，低溫灌裝環(huán)節(jié)一旦出現(xiàn)任何問題都可能導(dǎo)致大批產(chǎn)品污染，最常見的是腸桿菌和芽孢桿菌類的污染問題。芽孢桿菌因?yàn)槟蜔岫跉⒕髿埩?。而腸桿菌細(xì)菌污染，來自殺菌后二次污染，污染源可能來自水和空氣。這兩者均具有良好的流動(dòng)性和滲透性，而且在生產(chǎn)線上無處不在，一旦灌裝設(shè)備或包材出現(xiàn)哪怕是短暫的細(xì)小裂隙都會(huì)帶入細(xì)菌，非常難以防范和排查。而該類微生物多數(shù)是條件致病菌，需要重視其對食品安全的影響。

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