宣威火腿中生物胺的HPLC測(cè)定*

廖國(guó)周，王桂瑛，曹錦軒，程志斌

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南 昆明，650201)2(云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，云南昆明，650212)3(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江寧波，315211)4(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明，650201)

生物胺是游離氨基酸在肌肉內(nèi)源酶和微生物產(chǎn)生的外源酶催化作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的一類低分子量有機(jī)堿，主要包括酪胺、組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亞精胺等多種物質(zhì)［1］。適量的生物胺對(duì)人體健康有益，但當(dāng)機(jī)體攝入高濃度的生物胺后，會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，引起頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等不良癥狀，嚴(yán)重情況下可引起大腦出血，甚至死亡［2］。由于其具有潛在的毒性，目前對(duì)食品中生物胺的研究已成為熱點(diǎn)。

宣威火腿是云南省傳統(tǒng)名特優(yōu)產(chǎn)品，2001年獲得國(guó)家原產(chǎn)地域保護(hù)，它是由在原產(chǎn)地域內(nèi)飼養(yǎng)的含有烏金豬血統(tǒng)的鮮豬后腿在原產(chǎn)地域經(jīng)過(guò)修割定形、腌制、堆碼翻壓、洗曬整形、上掛風(fēng)干、發(fā)酵制作而成［3］。長(zhǎng)時(shí)間的腌制加工和發(fā)酵成熟過(guò)程使肌肉蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)變化，形成干腌火腿的特征風(fēng)味，同時(shí)也可能形成生物胺等副產(chǎn)物［4］。本研究旨在通過(guò)柱前衍生-HPLC方法測(cè)定宣威火腿中生物胺的種類與含量，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)宣威火腿的安全性提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

供試的成品宣威火腿購(gòu)于昆明當(dāng)?shù)爻?。樣品采集后于?0℃貯存待用。

1.2 主要儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀，配置四元泵、真空在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、Agilent化學(xué)工作站，美國(guó) Agilent公司;色譜柱:ZORBAX XDB－C18(4.6 mm ×250mm，5μm)，美國(guó) Agilent公司;Allegra 64R冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司;Ultra-Turrax T 25 basic分散器，德國(guó)IKA公司;超純水儀，美國(guó)Millipole公司。

1.3 試劑

色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品與丹磺酰氯均購(gòu)自Sigma公司;乙腈、丙酮均為色譜純;氨水、高氯酸、NaOH、NaHCO3等均為分析純。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 樣品前處理

取5 g宣威火腿樣品加入20 mL的0.4 mol/L高氯酸，以分散器徹底勻漿后在冷凍離心機(jī)中(4℃，3 000 r/min)離心10 min，收集上清液，沉淀物按上述方法再提取1次。將2次收集的上清液用0.4 mol/L高氯酸定容至50 mL。取1 mL定容后的樣品溶液，加入200 μL的2 mol/L NaOH，然后加入300 μL的飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，接著加入2 mL的丹磺酰氯衍生劑(濃度為10 mg/mL，溶劑為丙酮)，并在室溫黑暗中反應(yīng)處理30 min，反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL的氨水以終止反應(yīng)。最后以乙腈定容至5 mL。經(jīng)衍生處理的樣品液用0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后即可上機(jī)測(cè)定。

1.4.2 色譜條件

釆用二元流動(dòng)相體系:A為水，B為乙腈，其梯度洗脫程序見(jiàn)表1。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為 20 μL，柱溫為 40℃。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

50 mg各種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于0.4 mol/L高氯酸中，并定容至50 mL，得1 mg/mL各種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取各種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.4 mol/L高氯酸配制成終濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取 1 mL的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，按上述方法進(jìn)行衍生化，并上機(jī)分析，檢測(cè)結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 梯度洗脫程序

1.4.4 回收率、精密度和檢測(cè)限

準(zhǔn)確稱取相同的宣威火腿肉樣4份，每份5 g，其中3份分別加入質(zhì)量濃度為500 μg/mL的8種生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)液100、500、1000 μL，添加水平分別為1 mg/100 g、5 mg/100 g、10 mg/100 g，另 1 份不加，然后再進(jìn)行前處理及高效液相色譜分析(n=6)，扣除樣品中空白試驗(yàn)生物胺的含量，計(jì)算回收率和精密度。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的定義，本法的檢測(cè)限定義為產(chǎn)生相應(yīng)于3倍背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)偏差分析信號(hào)的濃度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、決定系數(shù)及方法的檢測(cè)限

以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為X，以HPLC測(cè)得相應(yīng)的峰面積為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)均大于0.99，各組分在0.5～20 μg/mL內(nèi)線性良好。據(jù)檢測(cè)限定義可知，亞精胺與精胺的檢測(cè)限為0.05 μg/mL，其余6種生物胺的檢測(cè)限均為0.1 μg/mL，可以滿足定量分析的需要。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、決定系數(shù)及方法的檢出限

2.2 方法的回收率與精密度

按回收率方法項(xiàng)操作，得到樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)液的回收率和精密度，見(jiàn)表3。結(jié)果可知，8種生物胺的加標(biāo)回收率的變異范圍為81.58%～95.58%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.48% ～5.85%。表明各濃度水平的加標(biāo)回收率和精密度均能達(dá)到檢測(cè)要求，說(shuō)明本方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)

2.3 宣威火腿中生物胺的種類與含量

圖1和圖2分別為生物胺標(biāo)準(zhǔn)品與宣威火腿樣品的紫外檢測(cè)色譜圖。由圖1可知，本檢測(cè)方法能有效地分離鑒定8種生物胺，且各組分峰尖銳、峰形對(duì)稱，20 min左右生物胺可被全部洗脫。圖2顯示，在與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品相同的保留時(shí)間里只出現(xiàn)6個(gè)峰，分別為苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亞精胺與精胺。

由表4可知，在宣威火腿樣品中并未檢測(cè)出色胺與組胺，只發(fā)現(xiàn)苯乙胺，腐胺，尸胺，酪胺，亞精胺與精胺6種生物胺，含量在0.37～4.28 mg/100 g，其中精胺含量最高，酪胺次之。目前對(duì)于干腌火腿中生物胺的分析報(bào)道較少，Wei等［4］在如皋火腿樣品中檢測(cè)出7種生物胺，分別是酪胺、苯乙胺、腐胺、精胺、色胺、尸胺和亞精胺，其中精胺含量最高，達(dá)2.65 mg/100 g。Virgili等［5］對(duì)意大利干腌火腿中生物胺的測(cè)定結(jié)果稍有不同，其中酪胺含量最大，其次是精胺，表明加工條件與前體物含量對(duì)干腌火腿中生物胺的種類與含量有重要影響。生物胺的毒性取決于個(gè)體的特性及其他胺的存在情況，如腐胺本身沒(méi)有毒性，但可作為酪胺與組胺毒性的增效劑［6］。Eerola 等［7］認(rèn)為，血管活性生物胺(色胺、苯乙胺、組胺與酪胺)的總量低于20 mg/100 g是發(fā)酵肉制品具有較高品質(zhì)的指標(biāo)之一。本研究釆用柱前衍生-HPLC方法首次對(duì)宣威火腿中生物胺含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)生物胺總量為11.56 mg/100 g，其中血管活性生物胺的含量遠(yuǎn)低于20 mg/100 g。該結(jié)果為進(jìn)一步研究加工過(guò)程中生物胺的消長(zhǎng)規(guī)律奠定基礎(chǔ)，并為評(píng)價(jià)宣威火腿的安全性提供依據(jù)。

圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的紫外檢測(cè)色譜圖

圖2 宣威火腿中生物胺的紫外檢測(cè)色譜圖

表4 宣威火腿中生物胺的種類與含量(n=3)mg/100 g

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