16S rRNA二級結(jié)構(gòu)分析在微生物分類鑒定中的應(yīng)用*

趙婷，李輝，程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100027)

二級結(jié)構(gòu)相比核苷酸一級序列具有更高的穩(wěn)定性，對于維系生物功能性極為重要。近年來，16S rRNA二級結(jié)構(gòu)圖形分析用于微生物分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析逐步發(fā)展起來?？莶菅挎邨U菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)生多種蛋白酶、淀粉酶、麥芽糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等［1－2］?？莶菅挎邨U菌(B．subtilis)的某些株為傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆的生產(chǎn)菌株。但是由于這兩個菌種16S rRNA基因同源性很高［3］，表型特征極其相似［4］，常規(guī)鑒定方法較難區(qū)分，本文通過16S rRNA二級結(jié)構(gòu)圖形分析比較，評估該方法用于區(qū)分枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)的可行性。

1 概念

16S rRNA二級結(jié)構(gòu)是指rRNA序列通過自身回折形成堿基配對的莖區(qū)(stem)以及不配對的發(fā)卡環(huán)(hairpin loop)、突環(huán) (bulge loop)、內(nèi)環(huán) (interior loop)、多支分環(huán)(multi-branched loop)等結(jié)構(gòu)。堿基配對的莖區(qū)對于二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到重要作用，而各種環(huán)區(qū)的形成會破壞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

1981年，Woese等［5］以Escherichia coli的 16S rRNA序列為基礎(chǔ)，根據(jù)化學(xué)修飾、蛋白結(jié)合、酶切片段等試驗數(shù)據(jù)，初步推斷并描述了16S rRNA二級結(jié)構(gòu)模型。1983年，Woese等［6］比較分析了真細菌域、古細菌域、真核生物域150余個物種的16S rRNA序列，論述了三域生物16S rRNA二級結(jié)構(gòu)與能量及功能之間的關(guān)系，提出序列比較方法是預(yù)測假設(shè)結(jié)構(gòu)的有力工具。1993年，Neefs等［7］完善和改進了Woese提出的模型，闡述了真細菌、古細菌、真核生物的核糖體小亞基的二級結(jié)構(gòu)模式圖及之間的區(qū)別。奧斯汀TEXAS大學(xué)Gutell實驗室建立的Comparative RNA Web(CRW)Site 數(shù)據(jù)庫［8－9］，包含有最近更新的參照菌株E．coliJ01695的16S rRNA二級結(jié)構(gòu)模型，同時包括rRNA二級結(jié)構(gòu)模型的演變歷程、新舊結(jié)構(gòu)模型的比較信息、核苷酸序列及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)等。rRNA二級結(jié)構(gòu)模型的建立揭示了微生物類群中核糖體結(jié)構(gòu)保守性一般大于序列保守性，并且二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與功能性緊密相關(guān)。

RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法主要包括最小自由能法和比較序列分析法。最小自由能算法是Zuker［10］在1981年提出的，發(fā)展至今已相當成熟，使用方便，預(yù)測成功率高，基于RNA structure軟件預(yù)測。比較序列分析法，由 Mathias［11］和 Lowe［12］于 1998 年和 1997年分別提出，比較序列分析法可靠性較強，但其預(yù)測結(jié)果強烈依賴于多序列比對的結(jié)果，操作繁復(fù)，工作量大。目前流行的做法是把兩者結(jié)合起來使用。

2 國內(nèi)外研究進展

16S rRNA二級結(jié)構(gòu)在微生物菌種分類及系統(tǒng)發(fā)育分析中有一定程度的應(yīng)用，Wisotzkey等［13］在1992年根據(jù)16S rRNA部分同源區(qū)段的二級結(jié)構(gòu)和脂肪酸類型從芽孢桿菌屬(Bacillus)屬劃分出一個新屬:脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus);1997年，MORI等［14］比較分析了Lactobacillus casei及其相關(guān)種16S rRNA 69位點至100位點的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該區(qū)段存在種水平差異;2003年，郭春雷等［15］預(yù)測并比較了棲熱菌屬(Thermus)16S rRNA部分區(qū)段的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明在種水平存在內(nèi)環(huán)、發(fā)卡環(huán)間堿基對數(shù)目的差異;2006年，陳國忠等［16］分析比較了姜氏菌屬(Jiangella)及相關(guān)屬16S rRNA可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)圖形差異，結(jié)果表明在9個可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)中莖的長度、環(huán)的數(shù)目和類型、莖的堿基對、環(huán)內(nèi)部堿基均有不同，認為該方法可以區(qū)分屬以上水平原核生物。2006年，姜怡等［17］分析比較了閆氏菌科(Yaniaceae)16S rRNA可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)，提出在9個可變區(qū)中，有2個以上不同的結(jié)構(gòu)單元可以定為新科，有1個不同的結(jié)構(gòu)單元可以定為新屬。除16S rRNA外，其他RNA二級結(jié)構(gòu)分子標志也有應(yīng)用，如2004年，Hong等［18］分析比較了靈芝屬(Ganoderma)線粒體小亞基V1、V4、V5、V6、V9可變區(qū)rRNA二級結(jié)構(gòu)，認為二級結(jié)構(gòu)用于分析靈芝屬系統(tǒng)發(fā)育線性關(guān)系是一個有力的工具;2007年，劉超洋等［19］分析了子囊菌門部分類群的18S rRNA二級結(jié)構(gòu)特征，認為二級結(jié)構(gòu)能更清晰地體現(xiàn)子囊果的演化歷程。

3 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)的16S rRNA可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)比較

從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲取研究菌株序列信息，運用Clustalx 1.83及RNA structure 4.6分析比較枯草芽孢桿菌(B．subtilis)ATCC 6051T(GenBank登錄號:AB271744)和地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)ATCC 14580T(GenBank登錄號:CP000002)的 16S rRNA可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)，表1顯示枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.lichenformis)16S rRNA保守區(qū)序列位點差異，圖1～圖3顯示枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)16S rRNA可變區(qū)二級結(jié)構(gòu)圖形。

表1 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)16S rRNA保守區(qū)序列位點差異

3.1 V2可變區(qū)180－230區(qū)段50nt 16S rRNA二級結(jié)構(gòu)比較

B．subtilis由2個莖、2個發(fā)卡環(huán)、1個突環(huán)組成，B．lichenformis由3個莖、2個發(fā)卡環(huán)、1個內(nèi)環(huán)、1個突環(huán)組成，兩者結(jié)構(gòu)明顯不同，關(guān)鍵堿基第4位堿基B．subtilis為 G，B．lichenformis為 C，該堿基的不同引起了兩者結(jié)構(gòu)的改變，其他 8、27、43、44、45 位堿基的不同沒有引起兩者結(jié)構(gòu)的改變。

圖1 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)V2可變區(qū)的二級結(jié)構(gòu)

3.2 V4可變區(qū)580－630區(qū)段50nt 16S rRNA二級結(jié)構(gòu)比較

B.subtilis由3個莖、2個內(nèi)環(huán)、1個發(fā)卡環(huán)、1個突環(huán)組成，B.lichenformis由3個莖、2個內(nèi)環(huán)、1個發(fā)卡環(huán)組成，兩者結(jié)構(gòu)明顯不同，關(guān)鍵堿基第12位堿基B.subtilis為 G，B.lichenformis為 C，第 15位堿基B.subtilis為 U，B．lichenformis為 G，這2 個堿基的不同引起了兩者結(jié)構(gòu)的改變。

圖2 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)V4可變區(qū)的二級結(jié)構(gòu)

3.3 V9可變區(qū)1430－1480區(qū)段50nt 16S rRNA二級結(jié)構(gòu)比較

B．subtilis由4個莖、2個內(nèi)環(huán)、2個發(fā)卡環(huán)、1個突環(huán)組成，B．lichenformis由5個莖、3個內(nèi)環(huán)、2個發(fā)卡環(huán)、1個突環(huán)組成，兩者結(jié)構(gòu)明顯不同，關(guān)鍵堿基第41位堿基B．subtilis為 A，B．lichenformis該堿基缺失，該堿基的缺失引起了兩者結(jié)構(gòu)的巨大變化。

圖3 枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)V9可變區(qū)的二級結(jié)構(gòu)

綜上分析，枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)16S rRNA二級結(jié)構(gòu)在V2、V4、V9共3個可變區(qū)有明顯不同，表明16S rRNA二級結(jié)構(gòu)分析可以用于兩者種水平鑒別。

4 結(jié)語

16S rRNA二級結(jié)構(gòu)分析(圖形結(jié)構(gòu)差異)，基于現(xiàn)有的海量核酸序列信息，提供更多的系統(tǒng)發(fā)育信息，為微生物菌種分類提供了有一個有意義的分子指征。隨著更多更準確的預(yù)測方法被開發(fā)出來，更多種屬樣本的驗證數(shù)據(jù)，更多因素的評估，如假結(jié)、細胞組成、堿基修飾、轉(zhuǎn)錄過程等，16S rRNA二級結(jié)構(gòu)也會越來越廣泛地用于系統(tǒng)分類和進化的研究。如2007年，Huang等［20］研究了包含假結(jié)的rRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，Pfold等［21］試圖應(yīng)用將系統(tǒng)進化樹來指導(dǎo)rRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測并獲得了突破。

枯草芽孢桿菌(B．subtilis)ATCC 6051T和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)ATCC 14580T16S rRNA共有28個保守差異堿基位點，本文嘗試了所有差異位點的二級結(jié)構(gòu)，只有文中選取的3個區(qū)段二級結(jié)構(gòu)有明顯差異。16S rRNA二級結(jié)構(gòu)分析可以在種水平對枯草芽孢桿菌(B．subtilis)和地衣芽孢桿菌(B．lichenformis)進行鑒別，期望為廣大生產(chǎn)企業(yè)及檢測檢驗機構(gòu)對菌種的使用、標識、檢測、鑒定提供理論及技術(shù)依據(jù)。

［1］ 飼料添加劑品種目錄.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第1126號，2008.

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