直投式酸奶發(fā)酵劑中雙歧桿菌的分離

陳杰，孫翠煥，吳英春，陳麗媛，馮華，徐沖

(遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000)

雙歧桿菌(Bifidobacterium)是Tissier博士從母乳喂養(yǎng)嬰兒的糞便中分離得到的一種專性厭氧、無運動性、無芽孢、無鞭毛及莢膜的革蘭陽性桿菌［1］，末端常分叉故名雙歧桿菌［2］，是人和動物腸道的重要生理性有益菌。近年來，雙歧桿菌對人體的健康作用研究越來越多，含有雙歧桿菌的發(fā)酵乳制品、腸道微生態(tài)制劑等產(chǎn)品已經(jīng)在相關(guān)領(lǐng)域占有一席之地。雙歧桿菌在腸道能合成B族維生素及氨基酸，促進(jìn)鈣、鐵的吸收;可保持腸道正常微生物菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性和特異性免疫反應(yīng)，降低血清膽固醇水平，有防癌抗癌、控制內(nèi)毒素血癥的作用［3］，其功能越來越受到人們的重視。本文介紹一種簡便的分離方法，針對直投式發(fā)酵劑中雙歧桿菌進(jìn)行菌種分離，從中分離生產(chǎn)性能優(yōu)良的雙歧桿菌，作為出發(fā)菌株，供企業(yè)技術(shù)人員及科研人員研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料進(jìn)口直投式酸奶發(fā)酵劑，標(biāo)注為雙歧桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌的混合凍干菌粉。

1.1.2 培養(yǎng)基［4］①WR1培養(yǎng)基(%)：酪蛋白胨1，牛肉膏0.5，酵母膏0.5，葡萄糖0.5，番茄6，丙酸鈉1，Na2S·9H2O 0.05，NH4Cl 0.1，MgSO4·7H2O 0.01，L-半胱氨酸0.05，刃天青0.000 1，pH 7;②WR2培養(yǎng)基(%)：大豆蛋白胨1，酵母膏1，葡萄糖1，山梨酸0.04，刃天青0.000 1，胡蘿卜汁5，鹽溶液4，L-半胱氨酸0.05，pH 7;③WR3培養(yǎng)基(%)：水解酪蛋白1，牛肉膏0.5，酵母膏0.5，葡萄糖1，LiCl 0.3，K2HPO40.05，KH2PO40.04，番茄汁5，維生素C0.3，L-半胱氨酸0.05，pH7;④酸化MRS培養(yǎng)基，調(diào)整pH 5.1;⑤M17培養(yǎng)基;⑥MRS培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，顯微鏡，高壓滅菌鍋。

1.2 方法

1.2.1 直投式發(fā)酵劑的菌種活化無菌條件下取少許菌粉轉(zhuǎn)入WR1液體培養(yǎng)基中，輕搖使菌粉融解，注意盡量避免空氣進(jìn)入。分別吸取上述菌液按4%(體積比)接入WR1、WR2、WR3 3種液體培養(yǎng)基中，輕搖使均勻。于CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)16 h，CO2濃度為20%。同樣操作，將菌液接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫有氧培養(yǎng)16 h。鏡檢觀察菌體生長情況。

1.2.2 平板劃線分離雙歧桿菌根據(jù)菌種活化結(jié)果，在WR1、WR2、WR3中選擇雙歧桿菌生長良好的培養(yǎng)基作為分離用平板培養(yǎng)基，以對應(yīng)培養(yǎng)液中活化的菌體作出發(fā)菌株，進(jìn)行劃線培養(yǎng)。37℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，CO2濃度20%。同樣操作，將MRS中活化的菌體分別在酸化MRS和M17培養(yǎng)基平板劃線，37℃恒溫有氧培養(yǎng)48～72 h。各做3個重復(fù)。觀察菌落生長情況。

1.2.3 雙歧桿菌的初步鑒定［1，3，5］①觀察菌落形態(tài)及顯微鏡觀察菌體形態(tài);②對菌體進(jìn)行革蘭染色，雙歧桿菌為革蘭陽性菌;③生長的氣體環(huán)境：挑取少許雙歧桿菌于最適培養(yǎng)基平板劃線，分別在CO2濃度為0%、5%、10%、15%、20%條件下37℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，各做3個重復(fù)，觀察菌落生長情況;④生長溫度試驗：挑取少許雙歧桿菌于最適培養(yǎng)基平板劃線，分別在20、37和46.5℃下培養(yǎng)48～72 h，CO2濃度為20%，各做3個重復(fù)，觀察菌落生長情況。

1.2.4 培養(yǎng)液中菌體計數(shù)方法吸取1 mL培養(yǎng)液，加無菌水23.5 mL，0.3%亞甲基蘭染液0.5 mL，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 直投式發(fā)酵劑的菌種活化

以WR1、WR2、WR3、MRS液體培養(yǎng)基為活化培養(yǎng)基，結(jié)果見表1。

表1 菌體活化情況Table 1 Activation of thallus

由表1可知，WR1、WR2、WR3培養(yǎng)液中均有3種菌生長，MRS培養(yǎng)液中有2種菌生長。從菌體形態(tài)可初步認(rèn)定，菌1為嗜熱鏈球菌。分析菌2和菌3，根據(jù)菌體的大小、菌體形態(tài)、甲基蘭染色等特性，初步認(rèn)定菌2為德氏乳桿菌保加利亞亞種，菌3為雙歧桿菌［1，3］。但還要經(jīng)過生理生化試驗才能做最后結(jié)論。本文只對桿菌做進(jìn)一步研究。菌3在培養(yǎng)基WR1中生長狀況好于其他3種，且綜合考慮菌1和菌2被抑制生長的情況，應(yīng)選擇WR1做為進(jìn)一步試驗用培養(yǎng)基。在MRS培養(yǎng)液中，只有菌1和菌2生長，根據(jù)經(jīng)驗，可用酸化MRS和M17培養(yǎng)基的瓊脂平板劃線法分離嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種。

2.2 平板劃線分離雙歧桿菌

依據(jù)表1結(jié)果，選擇WR1作為平板劃線分離雙歧桿菌的最佳培養(yǎng)基。本試驗可同時分離嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種。各培養(yǎng)基平板上單菌落形態(tài)及顯微鏡檢查結(jié)果見表2。由表2可知，在WR1平板上的單菌落a的形態(tài)與菌體狀態(tài)符合對雙歧桿菌的描述［1］。從菌落b和c的描述中，初步確定b為德氏乳桿菌保加利亞亞種，c為嗜熱鏈球菌。但酸化MRS和M17分別是二者的選擇培養(yǎng)基，在其平板上生長的單落更進(jìn)一步驗證了菌種的可能性。2菌種分別在MRS和M17斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存。如有需要，可依據(jù)二者的生理生化特點分別進(jìn)行鑒定。本文在此不再討論。

表2 菌落檢出情況Table 2 Detection of colony

2.3 雙歧桿菌的初步鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察結(jié)果見表2，均符合對雙歧桿菌的描述。

2.3.2 其他鑒定項目結(jié)果結(jié)果見表3。

表3 菌種鑒定情況Table 1 Identification of culture

從表3結(jié)果看出，試驗菌在37℃培養(yǎng)，CO2濃度低于5%時不生長，高于10%則隨著CO2濃度增加菌體生長旺盛，屬于厭氧菌。試驗菌在20%CO2濃度下，20℃和46.5℃均不生長，而在37℃生長旺盛。根據(jù)生理生化特性，從以上鑒定結(jié)果可初步確定，所分離的桿菌為雙歧桿菌。

3 討論

從本次分離試驗中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌的選擇性培養(yǎng)基并沒有完全抑制嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的生長。在查閱的相關(guān)資料中也有報道，當(dāng)雙歧桿菌被其他厭氧菌明顯超過時，雙歧菌的選擇分離問題尚未完全得到解決。在直投式酸奶發(fā)酵劑中，嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種2種兼性厭氧菌活力旺盛，可能影響了雙歧桿菌的純菌分離，試驗結(jié)果與資料報道相符。另有原因可能是進(jìn)口直投式酸奶發(fā)酵劑中的嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種本身是生產(chǎn)性能優(yōu)良菌株，對某些抑制劑有抗性，可能會出現(xiàn)上述結(jié)果。這些問題將在以后的工作中做深入研究。

［1］ 凌代文.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

［2］ 呂志勇，呂志剛.雙歧桿菌的保健功能及其產(chǎn)品研發(fā)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(19)：5031-5032.

［3］ 郭本恒編著.益生菌［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［4］ 馬鋼.酸奶及其飲料中雙歧桿菌分離培養(yǎng)與計數(shù)［J］.食品科學(xué)，1994，11(1)：51-52.

［5］ R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第8版)［M］.北京：科學(xué)出版社，1984.