甘草甜素對樹突狀細(xì)胞表型及生物學(xué)功能的影響

于洪濤，華慧，李偉偉，孟一鳴，李璇，張朕杰，單風(fēng)平

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽110001)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，能有效刺激初始型T細(xì)胞的增殖，是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動者，參與機(jī)體多種自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤及一些炎癥反應(yīng)的病理過程，在機(jī)體抗感染免疫及腫瘤應(yīng)答免疫中起重要作用［1-2］。甘草甜素(glycyrrhizin，GL)是中藥甘草的主要成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)等作用，現(xiàn)運(yùn)用于臨床各種疾病的治療，取得了明顯確切的療效［3-4］。鑒于甘草甜素和樹突狀細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的顯著地位，本實(shí)驗(yàn)就甘草甜素對小鼠髓系DC2.4細(xì)胞株表型及功能的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，并探討其免疫刺激功能及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 來源DC來源為C57小鼠髓系DC2.4細(xì)胞株，本教研室保存并傳代。

1.1.2 藥物與主要試劑甘草甜素，美國Sigma公司;IL-12 ELISA試劑盒，eBioscience;PE-MHCⅡ抗體、PE-CD86抗體、FITC-CD40抗體，BD Biosciences;酸性磷酸酶試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠髓系樹突細(xì)胞2.4(DC2.4)復(fù)蘇和培養(yǎng)取出凍存的DC2.4細(xì)胞，迅速放入37℃水浴中，不斷地?cái)噭又钡絻龃婀苤械募?xì)胞溶化。1 000 r/min離心10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液柔和地吹打，直到完全散開。將吹打后的液體轉(zhuǎn)移到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶(含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)中，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)后，放到溫度37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理甘草甜素溶解于RPMI 1640中，加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的DC細(xì)胞培養(yǎng)液中，甘草甜素濃度為12.5 μg/mL(預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此濃度效果最好)，RPMI 1640作為陰性對照，LPS(10 ng/L)作為陽性對照。①掃描電鏡觀察DC表面形態(tài)：按照上述藥物處理方法培養(yǎng)DC，48 h后收集細(xì)胞，經(jīng)過常規(guī)掃描電鏡制樣流程：戊二醛固定、清洗、鋨酸后固定、清洗、置換、臨界點(diǎn)干燥、粘臺、噴金，最后在掃描電鏡(JEOL.JSM-7300)下觀察;②流式細(xì)胞儀檢測DC表面分子：藥物處理過的細(xì)胞經(jīng)48 h培養(yǎng)后，用胰酶消化為細(xì)胞懸液，用FASC緩沖液(含2%FCS的PBS)洗2遍，1 000 r/min離心10 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，每管加0.1 mL細(xì)胞懸液，加PE標(biāo)記的MHCⅡ和CD86(BD Biosciences)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的CD40(BD Biosciences)單克隆抗體，4℃下溫育30 min，F(xiàn)ACS緩沖液洗2遍，然后用300 μL FACS緩沖液重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀(FACS Cabulir BD)上檢測;③體外刺激淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取1×106/mL DC細(xì)胞懸液作為刺激細(xì)胞，同時(shí)無菌取C57小鼠脾淋巴細(xì)胞4×107/mL作為反應(yīng)細(xì)胞。于96孔培養(yǎng)板每孔加入刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞各100 μL，并設(shè)反應(yīng)細(xì)胞自身對照。置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h于每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀讀570 nm處的吸光度值;④4-氨基安替比林(4-AAP)比色檢測DC內(nèi)酸性磷酸酶活性：DC經(jīng)藥物處理后培養(yǎng)48 h，再用胰酶消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，按照測酸性磷酸酶試劑盒(南方建成生物工程研究所)提供方法操作;⑤ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-12的分泌：DC經(jīng)甘草甜素和LPS作用48 h后收集上清，應(yīng)用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12的含量，試驗(yàn)按照購買的ELISA試劑盒(eBioscience)的步驟操作。反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光值(A450)，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定所測細(xì)胞因子的濃度。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以ˉχ±s表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)，樣本均數(shù)間的多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 掃描電鏡觀察DC表面形態(tài)

DC經(jīng)藥物刺激48 h，按照材料與方法中所述的制樣步驟處理后，在掃描電鏡下觀察其表面形態(tài)。如圖1所示，甘草甜素處理后的DC形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，有層疊狀的皺襞，細(xì)胞表面有長短不等的大量的樹枝樣突起，此外尚有短小的圓形、橢圓形突起，而陰性對照組DC細(xì)胞突起顯著減少，層疊不明顯。

2.2 甘草甜素對DC表面MHCⅡ、CD86、CD40表達(dá)的影響

DC高表達(dá)MHCⅡ、CD86、CD40是DC趨向成熟的標(biāo)志之一［2，5-6］。與陰性對照組(RPMI 1640)相比，12.5 μg/mL甘草甜素與LPS類似，能夠上調(diào)MHCⅡ、CD86、CD40的表達(dá)(P＜0.05)，即甘草甜素與LPS相似均能夠促進(jìn)DC的成熟(圖2)。

圖1 DC的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.1 Scanning eledtronic microscopy for DCs’morphology

圖2 甘草甜素能夠上調(diào)DC表面MHCⅡ、CD40、CD86的表達(dá)Fig.2 Up-regulation of the expressiong of MHCⅡ、CD40 and CD86 on the DCs after treatment with GL

2.3 甘草甜素對DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的影響

DC刺激同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的程度用A值(A570)表示。與對照組相比，甘草甜素組和LPS組刺激同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)(P＜0.05，表1)。

2.4 甘草甜素對酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶是溶酶體內(nèi)主要的效應(yīng)酶，酸性磷酸酶含量的下降說明溶酶體含量的減少，間接說明DC吞噬加工抗原的能力減弱，細(xì)胞趨向成熟。用甘草甜素刺激DC2.4 48 h后，與陰性對照組相比，甘草甜素組和LPS組酸性磷酸酶活性均下降(表2)。

表1 甘草甜素增強(qiáng)同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖(A570)(±s，n=6)Table 1 GL enhance the proliferation of allogenic spleen T lymphocytes(A570)(±s，n=6)

表1 甘草甜素增強(qiáng)同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖(A570)(±s，n=6)Table 1 GL enhance the proliferation of allogenic spleen T lymphocytes(A570)(±s，n=6)

GroupA570P RPMI 16401.48±0.07 LPS2.33±0.11＜0.01 GL1.56±0.05＜0.05

表2 甘草甜素下調(diào)酸性磷酸酶活性(A520)(±s，n=6)Table 2 GL enhance the activity of acid phophatase(A520)(±s，n=6)

表2 甘草甜素下調(diào)酸性磷酸酶活性(A520)(±s，n=6)Table 2 GL enhance the activity of acid phophatase(A520)(±s，n=6)

GroupA520P RPMI 16400.53±0.01 LPS0.44±0.03＜0.01 GL0.48±0.01＜0.05

2.5 ELISA檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清液IL-12含量

圖3 甘草甜素能夠增強(qiáng)DC對IL-12的分泌Fig.3 GL can enhance the ability of DC to secrete IL-12

IL-12是DC受刺激后比較特異的一種產(chǎn)物［7-8］。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(方程y=0.002 7x+0.060 3(R2=0.999 2))，與RPMI 1640組相比，甘草甜素處理的DC能夠增加DC培養(yǎng)液上清中IL-12的含量，LPS作為陽性對照。ELISA結(jié)果顯示DC在未做任何處理時(shí)(即RPMI 1640組)IL-12分泌量少((254.83±8.31)pg/mL)，甘草甜素和LPS處理的DC能夠分泌較高水平的lL-12(分別為(284.17±9.52)pg/mL、(306.67±8.75)pg/mL)，結(jié)果顯示甘草甜素與LPS類似，能夠促進(jìn)DC功能的成熟(圖3)。

3 討論

甘草甜素具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子功能，糾正Th1/Th2比例失衡的作用，主要通過抑制前列腺素合成的限速酶—磷脂酶A2的活性，減少前列腺素的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)IL-1的產(chǎn)生，從而促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生，促進(jìn)INF-γ的分泌，同時(shí)可能抑制IL-4的產(chǎn)生，從而使Th1的功能增強(qiáng)，抑制Th2的功能，調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡［9-10］。DC最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始型T細(xì)胞(naive T cells)增殖，因此DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動者，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答過程中具有獨(dú)特的地位。DC在體內(nèi)廣泛分布，是一種異質(zhì)性細(xì)胞群體，具有多種不同形態(tài)、表型和功能。正常情況下絕大多數(shù)體內(nèi)DC處于非成熟狀態(tài)，不成熟的樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，iDC)具有高效的抗原攝取和處理能力，因其低表達(dá)共刺激分子和主要組織相容復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)分子，對T細(xì)胞的激活作用差，故其抗原提呈能力較弱。未成熟DC在攝取抗原或接受到某些刺激因素(如LPS、TNF-α)后，細(xì)胞表面MHC-Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子如CD40、CD80/CD86、CD58表達(dá)增加，呈遞抗原的能力逐漸增強(qiáng)，而攝取、加工處理抗原的能力逐漸減弱，并同時(shí)向淋巴器官遷移，逐漸分化成熟，增殖并分泌多種細(xì)胞因子，最終發(fā)育為成熟樹突狀細(xì)胞(mature dendriticcells，mDC)［5］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的DC2.4細(xì)胞株是首先將GM-CSF轉(zhuǎn)染C57BL/6小鼠骨髓培養(yǎng)細(xì)胞，然后再轉(zhuǎn)染myc和raf癌基因而建立的永生化細(xì)胞株［11］。DC2.4具有很強(qiáng)的吞噬功能，是一種標(biāo)準(zhǔn)的用于DC研究用的未成熟的細(xì)胞系，目前多用于抗腫瘤的免疫治療。

DC的免疫功能有賴于其表面免疫分子的表達(dá)情況，DC對抗原多肽的提呈除需MHCⅡ類分子的參與外，T細(xì)胞的激活還需要其表面所表達(dá)的共刺激分子、黏附分子的參與。本實(shí)驗(yàn)研究了濃度為12.5 μg/mL的甘草甜素對DC2.4表型和功能的影響，研究結(jié)果表明，甘草甜素刺激后的樹突狀細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，有層疊狀的皺襞，細(xì)胞表面有長短不等的大量樹枝樣突起，細(xì)胞表面高表達(dá)MHCⅡ、CD86、CD40分子，且DC激活T細(xì)胞能力及T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，提示甘草甜素通過促進(jìn)DC膜免疫分子的表達(dá)進(jìn)而明顯提高DC抗原的提呈功能。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)12.5 μg/mL的甘草甜素降低了細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的活性，酸性磷酸酶是溶酶體內(nèi)主要的效應(yīng)酶，酸性磷酸酶含量的下降說明溶酶體含量的減少，間接說明DC吞噬抗原的能力減弱，遞呈能力加強(qiáng)，細(xì)胞趨向成熟。包括DC在內(nèi)的許多免疫細(xì)胞可分泌IL-12因子，主要作用于T細(xì)胞和NK細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答，DC在非刺激狀態(tài)即可產(chǎn)生IL-12，在受到細(xì)菌、病毒或其自身表面分子的配體的刺激下分泌更明顯［12］。IL-12還有強(qiáng)大的誘生干擾素的作用，故DC可通過IL-12介導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)檢測DC的培養(yǎng)上清中IL-12的含量，發(fā)現(xiàn)甘草甜素能夠促進(jìn)IL-12的表達(dá)。IL-12是DC的功能性產(chǎn)物，其含量的增高以及抗原提呈方面的成熟和形態(tài)學(xué)上的成熟是對應(yīng)的，IL-12含量的增加可以進(jìn)一步促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)CTL殺傷活性，刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ，抑制IgE合成。

甘草甜素是從中藥甘草提取的有效成分，具有免疫調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甘草甜素體外對DC2.4細(xì)胞株誘導(dǎo)培養(yǎng)出了表達(dá)成熟免疫表型的DC，并具有顯著的刺激T細(xì)胞增殖的作用，可特異性激活T細(xì)胞，同時(shí)可促進(jìn)DC功能性產(chǎn)物IL-12表達(dá)的增高。研究結(jié)果不僅為今后DC的誘導(dǎo)提供了一條經(jīng)濟(jì)便捷的途徑，而且為甘草甜素免疫治療提供了理論依據(jù)。

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