海水及海產(chǎn)品中溶藻弧菌的分離與鑒定

張曉艷，寧喜斌

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是腹瀉病原菌中的一員，為專性嗜鹽性弧菌。與其他致病弧菌一樣，廣泛分布于海洋和江河入?？诘乃蛑?，并且數(shù)量居海水類弧菌之首［1］，過(guò)去一直被認(rèn)為不致病或僅能引起部分創(chuàng)傷性感染而未受到重視，近年研究證實(shí)該菌與副溶血弧菌一樣是常見的病原菌［2-5］，為海洋環(huán)境的主要優(yōu)勢(shì)菌種之一［6］。溶藻弧菌可引起人類食物中毒、中耳炎和敗血癥等［7］，夏季是養(yǎng)殖動(dòng)物感染溶藻弧菌發(fā)病的主要季節(jié)，容易發(fā)生該菌引發(fā)的重大流行病，對(duì)我國(guó)特別是南方地區(qū)的海水養(yǎng)殖造成巨大威脅。目前，我國(guó)國(guó)標(biāo)中對(duì)溶藻弧菌的檢測(cè)方法還沒有具體規(guī)定，探討海水及海產(chǎn)品中溶藻弧菌的分離鑒定方法，對(duì)其進(jìn)行安全控制及以后建立溶藻弧菌的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株V.a ATCC 17749，購(gòu)于上海復(fù)祥生物公司。

1.1.2 樣品50份海水采集于上海東海近海，40份大黃魚購(gòu)于上海市水產(chǎn)市場(chǎng)，30份南美白對(duì)蝦購(gòu)于上海市南匯新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，25份貽貝購(gòu)于浙江嵊泗。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑3%NaCl的TCBS瓊脂、3%NaCl三糖鐵瓊脂、無(wú)鹽蛋白胨等培養(yǎng)基及鑒定用的生化試劑購(gòu)于上海市疾病預(yù)防控制中心;科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)于上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司;細(xì)菌柱式基因組DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒及所用引物等均購(gòu)于生工生物(上海)有限公司;瓊脂糖購(gòu)于加拿大Bio Basic INC公司;EB購(gòu)于上海華舜生物工程有限公司;DNA MakerⅠ購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 主要儀器PCR儀(PTC-200，美國(guó)Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的取樣及處理用無(wú)菌海水采樣器于東海近海不同區(qū)域采集海水，取水面下30～100 cm深處的海水，每個(gè)點(diǎn)取2份，每份500 mL，共50份海水。在上海市水產(chǎn)市場(chǎng)購(gòu)買新鮮的大黃魚，共40份，將購(gòu)置的樣品魚用75%乙醇體表消毒后，無(wú)菌取其內(nèi)臟、鰓及魚肉等。上海市南匯新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買新鮮的南美白對(duì)蝦，共30份。20份貽貝購(gòu)于浙江嵊泗，先用自來(lái)水將其外殼上的污泥沖掉，用75%乙醇消毒外殼邊緣，敲開外殼，以無(wú)菌操作取出內(nèi)臟或含內(nèi)臟的全部貝肉和貝液。將不同的水產(chǎn)品于滅菌的研缽中充分研碎，或用滅菌剪刀充分剪碎，取10 g樣品，放于裝有90 mL的3%NaCl的堿性蛋白胨水中，37℃增菌24 h。

1.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)增菌后，接種于3%NaCl的TCBS上，37℃培養(yǎng)18～24 h，每平板上挑取1個(gè)黃色菌落轉(zhuǎn)接至科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)無(wú)色菌落經(jīng)2～3次純化后，轉(zhuǎn)接于3%NaCl營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面20～25℃保存。

1.2.3 溶藻弧菌的初篩挑取可疑菌株進(jìn)行革蘭染色及氧化酶試驗(yàn)［8］，依次將可疑菌株分別接種于3%NaCl三糖鐵瓊脂斜面以及無(wú)鹽蛋白胨水和3%、6%、10%鹽蛋白胨水，37℃培養(yǎng)18～24 h。

1.2.4 溶藻弧菌的生化鑒定對(duì)于初篩試驗(yàn)中疑似溶藻弧菌的菌株進(jìn)一步做生化鑒定，包括蔗糖、乳糖、MR試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、明膠、脲酶、阿拉伯糖、D-甘露糖、D-甘露醇、D-纖維二糖及ONPG試驗(yàn)。試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)［8］，以溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17749作對(duì)照。1.2.5溶藻弧菌的PCR鑒定挑取可疑菌株的單菌落，接種到TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12～16 h，取3 mL菌液按照柱式基因組DNA提取試劑盒的方法提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)文獻(xiàn)［9］，HSP60基因序列是鑒定溶藻弧菌的特征基因，在GenBank中存取號(hào)為AY332570，PCR可擴(kuò)增出560 bp的條帶，若能在菌中檢測(cè)到此序列，則為溶藻弧菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻弧菌的初步分離

圖1 溶藻弧菌在TCBS瓊脂上的菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of V.a on TCBS agar

圖2 溶藻弧菌在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colonial morphology of V.a on CHROMager vibrio

樣品選擇性增菌后，在3%NaCl TCBS上的典型菌落為圓形黃色、大而光滑、濕潤(rùn)、較扁平(圖1);在3%NaCl科瑪嘉上的典型菌落為圓形無(wú)色、較小且濕潤(rùn)(圖2)。其中145份增菌液在TCBS瓊脂上得到黃色單菌落的有52份，從52份TCBS瓊脂上各挑取1個(gè)黃色單菌落轉(zhuǎn)接至科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上，得到無(wú)色菌落34份。這34株菌轉(zhuǎn)接斜面常溫保存1份，作為初步分離的菌株，做進(jìn)一步的初篩試驗(yàn)。

2.2 溶藻弧菌的初篩

將在科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上得到的34株可疑菌株進(jìn)行鏡檢，34株均為革蘭陰性菌，排列不規(guī)則，常呈短狀，略顯弧狀。將鏡檢后的34株菌株依次做氧化酶、三糖鐵及嗜鹽性試驗(yàn)后。溶藻弧菌氧化酶呈陽(yáng)性;在3%NaCl三糖鐵瓊脂斜面上產(chǎn)酸變黃，底層產(chǎn)酸變黃，不產(chǎn)H2S，不產(chǎn)氣;在無(wú)鹽蛋白胨水中不生長(zhǎng)，在3%、6%、8%、10%鹽蛋白胨水中生長(zhǎng)，其中在3%及6%鹽胨水中生長(zhǎng)較明顯。其中34株可疑菌株經(jīng)過(guò)氧化酶試驗(yàn)、3%NaCl三糖鐵試驗(yàn)和嗜鹽性試驗(yàn)后有1株在10%鹽蛋白胨水中不生長(zhǎng)，初篩得到33株可疑菌株。

2.3 溶藻弧菌的生化鑒定

對(duì)照溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的主要特征進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定，結(jié)果見表1。所有鑒定項(xiàng)目中除MR試驗(yàn)(+/-為27/6)和精氨酸脫羧酶試驗(yàn)(-/+為30/3)外，其他生化試驗(yàn)均與溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株V.a ATCC17749相符合，所以根據(jù)生化鑒定結(jié)果來(lái)看，初篩得到的33株均疑似為溶藻弧菌。

表1 分離菌生化特征及其與標(biāo)準(zhǔn)溶藻弧菌的比較Table 1 Comparison of isolated strains with standard V.a in biochemistry tests

2.4 溶藻弧菌的PCR鑒定

從海水及海產(chǎn)品中分離的33株經(jīng)過(guò)生化方法鑒定后，PCR均擴(kuò)增出560 bp的溶藻弧菌HSP60基因。部分溶藻弧菌PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3，其中條帶3、4、5、9、10、11比較亮，條帶6、7、8較暗，進(jìn)而從分子水平驗(yàn)證了分離得到的33株菌株均為溶藻弧菌。

圖3 部分分離的溶藻弧菌PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 PCR products of part V.a

2.5 溶藻弧菌的分離率

從海水及海產(chǎn)品中分離得到33株溶藻弧菌(表2)，其中海水中檢出9株，大黃魚檢出10株，南美白對(duì)蝦中檢出9株，貽貝中檢出5株，其中南美白對(duì)蝦中檢出率最高，高達(dá)30.0%。

表2 溶藻弧菌的分離率Table 2 The isolating rate of V.a from samples

3 討論

溶藻弧菌選擇性培養(yǎng)基和顯色培養(yǎng)基的選擇:145份樣品增菌后在TCBS瓊脂上分離得到的52份黃色菌株，轉(zhuǎn)接到科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基得到34份無(wú)色菌落，經(jīng)過(guò)生理生化及分子水平上鑒定有33株為溶藻弧菌。TCBS雖然是一種選擇性培養(yǎng)基，但是在其長(zhǎng)成黃色菌落除了溶藻弧菌，還有霍亂弧菌，而霍亂弧菌在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基是土耳其蘭色，溶藻弧菌是無(wú)色的。所以在分離溶藻弧菌時(shí)選用TCBS選擇培養(yǎng)基的同時(shí)，結(jié)合科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基分離，淘汰初篩階段的其他弧菌，可以較大的提高檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性。因此，可以將科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基用于分離溶藻弧菌檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及其他標(biāo)準(zhǔn)中。

溶藻弧菌分離鑒定方法的優(yōu)化:分離不同樣品中溶藻弧菌時(shí)，可將其進(jìn)行增菌后選用選擇性培養(yǎng)基TCBS進(jìn)行分離，挑取黃色可疑單菌落接種于科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上，挑取無(wú)色單菌落進(jìn)行生化鑒定，根據(jù)溶藻弧菌、副溶血性弧菌及霍亂弧菌間不同的生化特征，可選用V-P、蔗糖、阿拉伯糖、ONPG及嗜鹽性試驗(yàn)簡(jiǎn)化驗(yàn)證，最后用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步鑒定。

海水及水產(chǎn)品中溶藻弧菌帶菌率分析:從50份海水中分離鑒定得到9株溶藻弧菌，檢出率為18.0%。該結(jié)果略低于韓善橋等［10］報(bào)道的海水中溶藻弧菌的檢出率為25.9%，原因可能與本研究采樣的時(shí)間和地點(diǎn)有關(guān)，對(duì)于海水中溶藻弧菌的攜帶率，應(yīng)該引起海洋養(yǎng)殖戶和專業(yè)技術(shù)人員的重視，采取必要的措施來(lái)預(yù)防溶藻弧菌疾病的爆發(fā)和流行。從95份海產(chǎn)品中分離得到24株溶藻弧菌，檢出率為25.2%。其中南美白對(duì)蝦的檢出率較高于大黃魚與貽貝，這說(shuō)明海產(chǎn)品中攜帶溶藻弧菌的幾率比較高，在食用海產(chǎn)品或海產(chǎn)品加工過(guò)程中應(yīng)采取有效的滅菌方法。

近年來(lái)我國(guó)的食品安全問(wèn)題愈發(fā)突出，而食品安全問(wèn)題之一便是微生物問(wèn)題，而作為海水類弧菌數(shù)量之首的溶藻弧菌，對(duì)我國(guó)的海水養(yǎng)殖構(gòu)成了很大的威脅。因此，溶藻弧菌的分離鑒定顯得愈發(fā)重要，其方法的優(yōu)化對(duì)更方便、快速、準(zhǔn)確的鑒定溶藻弧菌具有重要的意義。

［1］ 封會(huì)茹，游京蓉，劉玉堂，等.溶藻弧菌引起暴發(fā)型食物中毒的病原學(xué)研究［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2003，15(4):331-334.

［2］ 潘曉藝，沈錦玉，尹文林，等.水生動(dòng)物的弧菌病及其致病機(jī)理［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21(3):272-277.

［3］ Ripabelli G，Sammarco M L，Grasso G M，et al.Occurrence of Vibrio and other Pathogenic bacteria in Mytilus galloprovincialis(mussels)harvested from Adriatic Sea，Italy［J］.International Journal of Food Microbial，1999，49(1-2):43-48.

［4］ Lee K K，Liu P C，Chen Y C，et al.The implication of ambient temperature with the outbreak of vibriosis in cultured small abalone Haliotis diversicolor supertexta Lischke［J］.Journal of Thermal Biology，2001，26(6):585-587.

［5］ 溫崇慶，薛明，何紅，等.兩株對(duì)蝦幼體弧菌病病原的分離和鑒定［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(3):346-352.

［6］ Thompson F L，Iida T，Swings J.Biodiversity of Vibrios［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68(3):403-431.

［7］ Ardic N，Ozyurt M.Case report:Otitis due to Vibrio alginolyticus［J］.Microbiology Bul，2004，38:145-148.

［8］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:370-384.

［9］ 李寧求，白俊杰，吳淑勤，等.斜帶石斑魚3種致病性弧菌的分子生物學(xué)鑒定［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29(3):356-361.

［10］ 韓善橋，虞積耀，姜濤，等.海水中致病弧菌分離及抗藥物敏感性分析［J］.中國(guó)抗生素雜志，2008，33(4):239-241.