廣東省一傳毒線蟲種——胼胝擬毛刺線蟲的調(diào)查研究

廖 力 遲遠(yuǎn)麗 邵曉勇 張衛(wèi)東 徐淼鋒 卓 侃 陳其文

(1.珠海出入出境檢驗(yàn)檢疫局 珠海 519015;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué))

1 前言

傳毒線蟲是一類重要的植物病原線蟲,它們不但可以直接取食危害植物,還可以傳播煙草環(huán)斑病毒、葡萄扇葉病毒、櫻桃銼葉病毒等植物病毒,對(duì)植物造成復(fù)合侵染,該類線蟲一直是國(guó)際植物檢疫重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。胼胝擬毛刺線蟲 (Paratrichodorus porosus)隸屬于毛刺科 (Trichodoridae)擬毛刺屬 (Paratrichodorus),是一種植物根系遷移性外寄生線蟲,可寄生 100多種植物,并且能傳播煙草脆裂病毒[1-4],嚴(yán)重危害植物生長(zhǎng)[5-7],包括花卉、果樹等許多經(jīng)濟(jì)作物,造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,2007年已被我國(guó)列為檢疫性有害生物。2008年 -2010年,筆者對(duì)廣東省主要地區(qū)的園林植物進(jìn)行傳毒類線蟲調(diào)查,其中在廣州市天河區(qū)灰木蓮 (Magnoliaceae glanca)上分離到胼胝擬毛刺線蟲。本文對(duì)該線蟲的形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)進(jìn)行了記述。

2 材料與方法

2.1 線蟲樣品的采集

采集灰木蓮根圍土樣約 1000g,取樣深度約50cm。取樣時(shí)盡量帶有寄主植物的部分根系,裝入封口塑料袋,做好標(biāo)簽。

2.2 線蟲的分離、殺死與固定

線蟲的分離采用過篩法(Brown et al,1988)[8],用 60-65℃水浴 2-3min方法殺死線蟲,并用 4%的 FG固定液 (40%甲醛:甘油:蒸餾水 =10:1:89)固定,保存以備鑒定。

2.3 線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

將固定好的線蟲制成臨時(shí)玻片,置于顯微鏡下觀察線蟲形態(tài)特征并測(cè)量形態(tài)數(shù)據(jù)。根據(jù)形態(tài)特征及測(cè)計(jì)值進(jìn)行線蟲屬、種的鑒定。

分類鑒定主要采用目前國(guó)際上普遍接受的Decraemer[5]的毛刺科分類系統(tǒng),形態(tài)測(cè)計(jì)采用De Man公式,測(cè)量與統(tǒng)計(jì)采用的英文及縮略詞參見文獻(xiàn)[9]。

2.4 DNA鑒定

2.4.1 線蟲 DNA的提取

采用微量 DNA提取法[10],在載玻片上滴 16μL預(yù)冷的WLB液(2.5 mmol/L DTT,1.125%吐溫 20,0.025%明膠,2.5倍 PCR緩沖液),挑入 1條線蟲,用手術(shù)刀將線蟲切成多段,迅速吸取含盡量多的線蟲片段的懸浮液 8μL,加到含 10μL無菌水的200μl Eppendorf管中,再向管中加入 2μL預(yù)冷的2mg/mL蛋白酶 K,使總體積為 20μL,迅速放入 -70℃冰箱 10 min以上。接著將 Eppendorf管置于65℃恒溫 60 min,95℃恒溫 10 min,最后 12000 g離心 30s。此時(shí)即得到DNA懸浮液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 D2D3區(qū)擴(kuò)增

采用 D2A(5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’)和 D3B(5’-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3’)[11]對(duì) 28S RNA基因 D2D3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:DNA模板 10-20 ng,Ex Taq(5U/μL)0.125μL,10 ×PCR緩沖液 2.5μL,dNTP(2.5 mmol/L)2μL,引物 (10?mol/L)各 1 μL,加無菌水至 25μL。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3min;接著 94℃變性 1min,57℃退火 45s,72℃延伸2min,共 40個(gè)循環(huán);72℃延伸 10min。

2.4.3 序列分析

將電泳分離的 PCR產(chǎn)物切膠回收,連接到 pMD 18-T載體,最后轉(zhuǎn)化克隆送交華大基因生物公司測(cè)序。序列結(jié)果在 NCB I(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上進(jìn)行核酸同源性檢索,檢索程序采取 nucleotide blast,即核酸序列對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索。序列相似性分析采用軟件 DNA Star進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)描述

雌蟲:熱殺死后蟲體直,角質(zhì)層顯著膨脹,瘤針向腹面彎。食道球沒有縊縮,腸沿食道球背面延伸從背面覆蓋食道球。背食道腺核位于食道腺的前部,后亞腹食道腺核略靠后。排泄孔位于食道球前部。雙生殖腺對(duì)生,卵巢轉(zhuǎn)折,陰門位于蟲體中部稍后 (V=54.14,56.21)。在陰門前觀察到 2個(gè)腹中體孔,陰門后觀察到 3個(gè)腹中體孔。陰道呈梯形,陰道長(zhǎng)占陰門處體寬的 27.42%和 31.1%。陰門骨化結(jié)構(gòu)側(cè)面觀呈卵圓形。肛門很靠后,幾乎端生。(圖1)

雄蟲:未發(fā)現(xiàn)。

寄主:灰木蓮。

形態(tài)測(cè)量值及與文獻(xiàn)記述的比較見表 1。

圖 1 胼胝擬毛刺線蟲光學(xué)顯微鏡形態(tài)圖

表 1 胼胝擬毛刺線蟲廣東種群測(cè)量值及與文獻(xiàn)記述的比較 (單位:μm)

3.4 D2D3區(qū)序列分析

對(duì)該線蟲群體 28S rRNA的 D2D3區(qū)序列進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序,得到了大小為 795bp的片段。該序列與 NCB I登錄號(hào)為 GU6459341的胼胝擬毛刺線蟲序列最為接近,用 ClustalW方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)序列之間的相似性為 99.7%。

4 討論

胼胝擬毛刺線蟲 (Paratrichodorus porosus)最早由Allen(1957)在美國(guó)加利福尼亞州芭蕉根部發(fā)現(xiàn),當(dāng)時(shí)命名為 Trichodorus porosus Allen,1957,現(xiàn)在此名為該種線蟲的次異名。該種線蟲另外 3個(gè)次異名是:Paratrichodorus(Nanidorus)porosus(Alen,1957)Siddiqi,1974;Nanidorus porosus(Allen,1957)Sid-diqi,1974和Trichodorus bucriusLordello&Zamith,1958。本次記述的胼胝擬毛刺線蟲廣州群體的主要形態(tài)特征與 Decraemer[5]和 Zheng等[12]的描述基本一致;擴(kuò)增測(cè)序得到的 28S rRNA的 D2D3區(qū)序列與NCB I上登錄號(hào)為 GU6459341的胼胝擬毛刺線蟲相似性高達(dá) 99.7%,故定為該種。

胼胝擬毛刺線蟲主要分布在美國(guó)、日本、葡萄牙、伊朗、越南和智利等 10多個(gè)國(guó)家,在我國(guó)僅云南、福建、浙江和廣東有分布[13-16];其寄主范圍廣泛,多達(dá) 100多種,包括菠菜、胡蘿卜、大豆、豌豆、豇豆、番茄、玉米、梨、桃、香蕉、葡萄、柑橘等。在日本,此線蟲還可寄生 5種針葉樹和 26種闊葉樹。本次在廣州天河區(qū)的寄主植物灰木蓮上分離到胼胝擬毛刺線蟲尚屬首次報(bào)道,它對(duì)于相關(guān)部門開展針對(duì)性的檢疫工作,保障廣東省園林植物的順利出口具有積極的意義。

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