五種馬病毒基因芯片檢測方法的建立

汪 琳 周 琦 柏亞鐸 邢佑尚,2 趙胤澤,2 張鶴曉 蒲 靜 喬彩霞 蔣 迪 齊瑋

(1.北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);3.博奧生物有限公司)

1 前言

非洲馬瘟[1]是馬科動物的非接觸性傳染病,被世界動物衛(wèi)生組織列為必須檢疫的重大動物疫病。由于該病的巨大破壞性,在國際上進行馬的運輸過程中,尤其是在無 AHS的地區(qū),必須執(zhí)行嚴格的獸醫(yī)衛(wèi)生措施。西尼羅病毒[2]于二十世紀九十年代在歐洲和美洲開始暴發(fā),隨后在西半球不斷蔓延,不僅幾乎傳遍整個美國,而且還進入到加拿大、墨西哥和西印度群島等地區(qū),并成為這些地區(qū)一個重要的公共衛(wèi)生問題。2003年 SARS的出現(xiàn),引起人們對冠狀病毒[3]極大的關(guān)注。迄今為止,我國尚未發(fā)現(xiàn)這些病毒感染的臨床病例,但是我國的氣候、地理環(huán)境復(fù)雜,蚊蟲種類繁多,具備傳播條件,隨著國際交流的日益頻繁,傳入我國境內(nèi)的可能性非常大。預(yù)防病毒意外傳入的第一步是檢測,由于我國目前尚沒有非洲馬瘟、西尼羅熱等病毒的病原體,長期以來一直無法開展針對這些病毒的系統(tǒng)研究,缺乏對這些可能傳入我國的重大傳染病的快速、靈敏和特異的診斷技術(shù),一旦發(fā)生意外傳入和暴發(fā)事件將難以應(yīng)對。因此很有必要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),在無病原體的情況下建立非洲馬瘟病毒、西尼羅熱病毒等的檢測方法,為防止這些病毒的傳入和發(fā)生突發(fā)感染事件時迅速排查可疑病例、鑒定病原以及采取有效的預(yù)防和控制措施提供技術(shù)支撐。

基因芯片技術(shù)[4]可將大量已知序列的核酸作為探針固定在玻片等載體上,與互補的核苷酸序列雜交,通過芯片雜交信號,判斷待檢樣品中有無可疑病原體,一次試驗可得出多條信息,具有快速、高通量、并行處理等優(yōu)點,在疾病篩查中具有無可比擬的優(yōu)勢。本研究將芯片技術(shù)用于五種馬病檢測中,建立了同時檢測五種馬病病毒的芯片檢測快速篩查技術(shù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 質(zhì)粒、宿主菌、病毒及血清

原核表達質(zhì)粒 PET-30a、大腸桿菌 (E.coli)BL21(DE3)、馬鼻肺炎病毒和馬動脈炎病毒[5]、待檢血清為北京出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存;非洲馬瘟阻斷 EL ISA試劑盒 (內(nèi)含馬的 AHSV標準陽性血清和陰性血清)購自西班牙 I NGENASA公司;西尼羅病毒購自美國 Fort Dodge Animal Health公司的滅活疫苗;馬冠狀病毒克隆質(zhì)粒引自澳大利亞獸醫(yī)研究所。

2.1.2 引物、探針序列合成與驗證

引物序列:

EAV F-1:TTGTGGTGACGGGATTTTAG EAV R-1::TGTAGCTTGTAGGCTGTCGC

EAV F-2:GGCGACAGCCTACAAGCTAC EAV F-2:CGGCATCTGCAGTGAGTGA

EHVF:ACACGCAGGTCGCTACTAT EHV R:CTCTAGTTGTTTGGCGGTGA

ECV F:CAAACCAGAGGTAGGAGAGC ECV R:GTGCCATACTGGGCTTTAG

WNV F:CACAATGACAAACGTGCTG WNV R:CTTCCTATTGCCTTGGTAGA

AHSV F:GCGATAGCAGCAAGAGCCT AHSV R:GGCCTCATCGATACCGAATGA

每對引物的上游引物的 5’端標記熒光,用于雜交檢測。

探針序列:

EAV orf6:AAATGGACCGAAGACGAGG EAV orf7:TCATAAAGAACCGCTGTACG

EHV-4 gB:CGTTTGTGTAGGCGATGTAG ECV N:ATACCAGCGTGGCAACAAT

WNV: TGTCCACCACTCCTTGTCTG AHSV:ACTCTCGCATCTGTCACTGT

人工合成的AHSV病毒片段:

AHSV-1

GCGATAGCAGCAAGAGCCTTGTCCGTTGTACG GGCATGCGTCACAGTGACAGATGCGAG

AHSV-2

TTGCAATCCCTAACGTCTCCATCACTCCTGGAT CCAAGCTAACTCTCGCATCTGTCACT

AHSV-3

CCTCATCGATACCGAATGATTCGTTAAACCATT GTACCTATTAATTGCAATCCCTAACG

2.1.3 主要試劑及儀器

Cy3-dCTP購自 Amersham Biosciences公司 ;芯片、雜交盒、芯片掃描儀 (Luxscan 10k/B)博奧生物有限公司生產(chǎn),其他化學(xué)試劑均為分析純。

2.2 方法

2.2.1 核酸模板制備

本項目中檢測的五種病原體來源不同,擴增模板的制備也不相同。EAV病毒和 EHV-4病毒模板采用MN提取試劑盒提取的 EAV病毒 RNA和EHV-4病毒 DNA;ECV病毒和WNV病毒擴增模板為質(zhì)粒模板;AHSV為人工合成的核酸片段,先用PCR擴增進行連接,擴增后的產(chǎn)物與 T-載體連接過夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化后的菌株進行培養(yǎng)和篩選,篩選出的克隆進行測序驗證,驗證正確的菌株進行質(zhì)粒提取,提取的質(zhì)粒用于 PCR擴增。

2.2.2 多重不對稱 RT-PCR擴增

本項目需要同時檢測馬病的五種病毒,因此建立多重不對稱 RT-PCR擴增體系。實驗中上游熒光標記引物濃度相同,均為 0.2μM,下游引物濃度根據(jù)設(shè)定的引物比例進行調(diào)整。整個反應(yīng)循環(huán)程序分為正常的擴增和高溫退火兩個階段。

2.2.3 芯片上探針點陣排布

芯片上點制 2條陰性對照、3條陽性對照和 5條病毒檢測探針,每條探針設(shè)置三個重復(fù)。陰性對照是合成的一段植物基因片段,陽性對照為合成的與靶基因沒有同源性的核酸片段,以監(jiān)控雜交反應(yīng)是否有效。

2.2.4 芯片雜交反應(yīng)

芯片雜交液組成成分為:10μL雜交緩沖液 +8μL PCR產(chǎn)物,雜交溫度 50℃,雜交時間 2h。雜交后的芯片洗滌后掃描,掃描參數(shù)為:激光 Power 90%,PMT 70%。

2.2.5 芯片特異性和靈敏度實驗

分別提取馬傳染性貧血病毒 (EIAV)、馬腺病毒I型 (EHV-1)、牛鼻氣管炎病毒 (IBRV)、豬胃腸炎病毒 (TGEV)的 RNA,擴增與芯片雜交,驗證芯片檢測體系的特異性。

對建立的檢測體系進行靈敏度評價,實驗方法為:對 AHSV、ECV和WNV質(zhì)粒,EAV和 AHV病毒核酸進行紫外定量,算出濃度 (1A260吸光度值 =ds DNA50mg/mL=ss DNA33mg/mL=ss RNA40mg/mL),根據(jù)病毒的分子量算出病毒的拷貝數(shù),然后對提取的核酸溶液進行 10倍系列稀釋,用稀釋后的核酸溶液做為模板進行多重擴增,擴增后的產(chǎn)物進行芯片雜交,根據(jù)雜交結(jié)果判斷每種病毒的檢測下限?？截悢?shù)計算公式:(6.02×1023copies/mol)×(濃度 g/mL)/(MW g/mol)=copies/mL。

2.2.6 芯片檢測重復(fù)性實驗

按照優(yōu)化好的芯片反應(yīng)體系,對 5種馬病病毒同時檢測,進行 3個重復(fù)實驗,根據(jù)掃描結(jié)果,驗證芯片重復(fù)性。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針有效性的驗證

通過實驗篩選雜交信號強,相互無交叉反應(yīng)的檢測探針,最后篩選出了用于五種病毒檢測的 5條探針,芯片雜交效果見圖 1,用于多重檢測體系的建立。

圖 1 馬病病毒探針驗證結(jié)果

3.2 特異性驗證

分別提取 EI AV、EHV-1、I BRV和 TGEV的RNA,經(jīng) RT-PCR和擴增后分別與芯片進行雜交,掃描結(jié)果顯示,除陽性參照外,其余位點均無雜交信號,說明設(shè)計的引物與其他病毒無交叉反應(yīng)。

圖 2 交叉反應(yīng)實驗驗證結(jié)果

圖 3 五種病毒混合雜交反應(yīng)結(jié)果

3.3 芯片檢測體系的建立

通過對引物濃度、多重 PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)、雜交溫度、雜交時間的優(yōu)化,建立了馬病芯片檢測體系:上下游引物濃度比例為 5:1,第一步 PCR為 25個循環(huán)和第二步 PCR為 15個循環(huán),雜交溫度為 50℃,雜交時間為 2h。五種病毒核酸同時與芯片雜交,無干擾現(xiàn)象都能出雜交信號,見圖 3所示。

3.4 馬病芯片檢測靈敏度評價

對建立的檢測體系進行了靈敏度評價,實驗結(jié)果見圖 4。

圖 4 芯片檢測體系各病毒靈敏度評價

雜交結(jié)果顯示,EAV病毒、ECV質(zhì)粒樣品、WNV質(zhì)粒樣品檢測靈敏度為 102copies;AHSV質(zhì)粒樣品檢測靈敏度為 104copies;EHV-4病毒樣品質(zhì)粒樣品檢測靈敏度為 103copies。

3.5 芯片檢測重復(fù)性實驗

圖 5 芯片雜交檢測體系重復(fù)性

3.6 進口馬全血樣品的基因芯片篩查

將馬病基因芯片應(yīng)用于 450份臨床馬血清的篩查,非洲馬瘟、西尼羅熱、馬冠狀病毒全部為陰性,檢出 6份馬動脈炎病毒陽性,2份馬鼻肺炎病毒陽性,與病毒中和試驗結(jié)果一致。

4 討論

基因芯片檢測方法具有快速、靈敏和高通量等特點,可對多個基因位點的信息進行分析,可最大限度保證檢出率。本研究建立的馬病芯片檢測方法,在一次實驗中可同時檢測 5種馬病毒,將檢疫檢疫時間由 1-2周縮短在 7h內(nèi)完成。芯片上設(shè)置了芯片表面化學(xué)質(zhì)控點、雜交陽性對照點、空白對照點和每種病毒核酸對應(yīng)的特異核酸探針,并且每條探針點設(shè)置 3個平行重復(fù),只有 3個點同時出現(xiàn)信號才判定為有效結(jié)果,有效避免了檢測過程中易出現(xiàn)的假陽性、假陰性現(xiàn)象,對芯片檢測體系的重復(fù)性試驗表明所建立的檢測體系具有很好的重復(fù)性,芯片批間差異輕微,本研究建立的芯片快速高通量基因芯片檢測方法可應(yīng)用于大規(guī)模出入境馬屬動物的快速篩查。

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[5] 朱來華,陸承平,梁成珠,等.馬皰疹病毒 1型 gD基因主要中和抗原區(qū)在大腸埃希氏菌中的表達 [J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(12):929-932.