高效液相色譜法測定畜禽組織中的三聚氰胺

張靜 李云 趙立軍 林順全

(農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心 四川成都 610041)

1 前言

三聚氰胺 (melamine)簡稱三胺,學(xué)名三氨三嗪,別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺,是一種用途廣泛的有機(jī)化工原料,包括用于蒸煮器具和餐具,有些國家也批準(zhǔn)用于化肥,但世界上沒有任何國家批準(zhǔn)其用于人類或動物食品。三聚氰胺含氮量高達(dá) 66%,一些不法個(gè)人和企業(yè)為達(dá)到提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)檢測含量的目的,在飼料和牛奶中非法添加以謀取利益,對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生了不利影響,對人類健康也造成了嚴(yán)重威脅。2007年 3月美國寵物“毒糧”事件[1]和 2008年 9月我國三鹿“毒奶粉”事件均是由三聚氰胺引起,造成了重大的生命財(cái)產(chǎn)損失,也嚴(yán)重影響了“中國制造”的聲譽(yù)。

人體攝入一定量的三聚氰胺會造成生殖系統(tǒng)損害,可導(dǎo)致腎結(jié)石,甚至膀胱癌。而人體攝入三聚氰胺的途徑主要是通過食品,其中包括動物源食品,即畜禽組織。飼料中的三聚氰胺可以經(jīng)食物鏈進(jìn)入畜禽組織,再進(jìn)入人體,這可能會給人類的健康帶來不良影響。

現(xiàn)有的三聚氰胺檢測方法的檢測對象多為化工產(chǎn)品、飼料以及奶制品等,有電位滴定法[2]、酶聯(lián)免疫分析法[3]、高效液相色譜法[4-7]、毛細(xì)管電泳法[8]、氣相色譜質(zhì)譜法[9]、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]。本文經(jīng)試驗(yàn)摸索,建立了畜禽組織中三聚氰胺的高效液相色譜法,針對畜禽產(chǎn)品中脂肪和蛋白含量較高的特點(diǎn),增加了脫脂和除蛋白步驟,優(yōu)化了凈化條件,避免了此類高脂肪蛋白含量的樣品對色譜柱的傷害,方法簡便、準(zhǔn)確,將對三聚氰胺的檢測范圍擴(kuò)展到畜禽組織,所采用的高效液相色譜法對畜禽組織中三聚氰胺進(jìn)行檢測在國內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道,這對保障我國畜產(chǎn)品質(zhì)量安全和國民健康具有重要的意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀,配有紫外檢測器。實(shí)驗(yàn)室用絞碎機(jī);DENVER分析天平;H ITACH I離心機(jī);M I LL IPORE超純水器;IKA T10均質(zhì)器;XH-B型渦旋混合器;IKA HS501振蕩器;帶蓋塑料離心管;N-EAP 112氮吹儀;Waters OasisMCX固相萃取小柱;Agilent固相萃取裝置。

2.1.2 試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品 (Dr Ehrenstorfer GmbH);甲醇(色譜純);乙腈 (色譜純);辛烷磺酸鈉 (色譜純);檸檬酸 (色譜純);三氯乙酸 (分析純);乙酸鉛 (分析純);氨水 (分析純);超純水等。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液

稱取 100mg(精確到 0.1mg)的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容于 100mL容量瓶中,配制成濃度為 1mg/mL的貯備液,于 2℃ -8℃冰箱內(nèi)保存。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)貯備液于容量瓶中,用流動相溶液稀釋,定容,分別配制成濃度為 2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。置于 2℃-8℃冰箱中保存。

2.2.2 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclispe XDB C18柱 (柱長150mm,內(nèi)徑 4.6mm,粒度 5μm);檢測波長:240nm;柱溫:30℃;流動相:(0.01mol/L辛烷磺酸鈉+0.01mol/L檸檬酸):乙腈 =90:10;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣體積 :20μL。

2.2.3 樣品的制備

2.2.3.1 提取

稱取試樣 2g(精確至 0.01g)于帶蓋塑料離心管,加入約 25mL乙醚,均質(zhì),搖床上振蕩 20min,棄去乙醚,重復(fù)以上步驟一次。準(zhǔn)確加入 18mL三氯乙酸溶液和 2mL乙酸鉛溶液,搖勻,均質(zhì),渦旋提取2min,在 10000r/min離心機(jī)上離心 5min,上清液備用。

2.2.3.2 凈化

分別用 3mL甲醇,3mL水活化混合型陽離子交換固相萃取柱,準(zhǔn)確移取 10mL上清液分次上柱,控制過柱速度在 1mL/min以內(nèi)。再用 3mL水和 3mL甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱,抽近干后用 5%氨水甲醇溶液 6mL洗脫。洗脫液 50℃氮?dú)獯蹈?準(zhǔn)確加入流動相溶液 1.0mL,渦旋振蕩 30s,過 0.45?m濾膜,上機(jī)測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍

將濃度分別為 2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、200.0μg/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣 20μL,以進(jìn)樣濃度 C(μg/mL)為橫坐標(biāo),以峰面積 A為縱坐標(biāo),做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。實(shí)驗(yàn)測得三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液在 2.0-200.0μg/mL濃度范圍內(nèi)的回歸方程為 Y=82.025X+0.6012,相關(guān)系數(shù) r=0.9998,表明具有良好的線性關(guān)系。

3.2 方法準(zhǔn)確度和精密度

為考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,對空白豬肌肉、豬肝、雞肉、鴨肉分別進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn),采用 3個(gè)不同水平的添加量,每個(gè)水平平行測定 6份?；厥章蕼y定結(jié)果見表 1,結(jié)果表明,平均回收率在72.9%-84.5%,RSD＜5%,方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表 1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.3 方法定量限

在本試驗(yàn)條件下,將一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白樣品中,經(jīng)提取、凈化后測定,根據(jù)信噪比(S/N)=10的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù),得出方法的定量限為 2 mg/kg,定量限濃度的樣品色譜圖見圖 1。

圖 1 定量限濃度的樣品色譜圖

4 討論

4.1 流動相和色譜柱的選擇

目前液相色譜法測定三聚氰胺選用的流動相和色譜柱主要有兩種,根據(jù)所用的色譜柱選擇相應(yīng)的離子對試劑做流動相。若采用 C8柱,則用庚烷磺酸鈉離子對試劑;若采用 C18柱,則用辛烷磺酸鈉離子對試劑。采用兩種色譜柱及相應(yīng)的流動相,在相同的色譜條件下,測得三聚氰胺色譜峰響應(yīng)相當(dāng),而三聚氰胺在 C18柱有更好保留。本實(shí)驗(yàn)最終選擇更常用的 C18柱,經(jīng)條件優(yōu)化,最終選擇乙腈:(0.01mo l/L辛烷磺酸鈉與0.01mol/L檸檬酸)緩沖液以 10:90的比例作為分析用流動相。

4.2 檢測波長的選擇

將 5.0μg/mL濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在 200-400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,光譜圖見圖 2。顯示三聚氰胺在約 240nm處有最大吸收,故選擇240nm最為檢測波長,這也與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的檢測波長一致。

圖 2 三聚氰胺紫外光譜圖

4.3 提取、凈化條件的選擇

三聚氰胺為弱堿性化合物,其在酸性水溶液中易溶,采用三氯乙酸進(jìn)行提取效果良好。由于畜禽組織中含有大量脂肪和蛋白質(zhì),容易對色譜柱造成損害,需預(yù)先除去。先后試驗(yàn)了正己烷脫脂、自制過三氧化二鋁小柱脫脂和乙醚脫脂三種方法,經(jīng)比較,用乙醚脫脂簡便易行,且回收率較高。另外,添加適量飽和乙酸鉛溶液能達(dá)到良好的除蛋白效果。

三聚氰胺在酸性條件下成陽離子狀態(tài),采用MCX柱 (陽離子交換小柱)凈化,專屬性較高,凈化效果明顯。試驗(yàn)對淋洗、洗脫溶劑及體積進(jìn)行了優(yōu)化,根據(jù)MCX小柱的推薦方法,依次采用水、甲醇對小柱進(jìn)行淋洗,采用堿性溶劑氨化甲醇進(jìn)行洗脫。分別試驗(yàn)了 2%-10%氨化甲醇的洗脫效率,結(jié)果表明采用 6mL5%的氨化甲醇洗脫回收率最高。

5 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜測定畜禽組織中三聚氰胺的實(shí)驗(yàn)方法。所樣品前處理操作簡單,易于掌握。方法經(jīng)驗(yàn)證具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度,可以滿足分析要求,適用于畜禽組織中三聚氰胺的檢測。

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