兩種 SPE凈化測(cè)定克倫特羅等β2-受體激動(dòng)劑的基質(zhì)效應(yīng)

王國民 彭濤 陳冬東 郗存顯 李應(yīng)國

(1.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 重慶 400020;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)

1 前言

β2-受體激動(dòng)劑是一類人工合成藥物,主要用于防治人、獸支氣管哮喘及痙攣。研究發(fā)現(xiàn)該類藥物添加到飼料中后具有營養(yǎng)再分配作用,可以顯著提高動(dòng)物的瘦肉率而曾被作為促生長添加劑受到廣泛關(guān)注。由于長期使用、屠宰前期使用或?yàn)E用β2-受體激動(dòng)劑,會(huì)造成其在動(dòng)物組織中的大量殘留,進(jìn)入人體后引起肌肉振顫、心動(dòng)過速、心悸和過敏等急性中毒癥狀[1],甚至嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)能力[2]和生殖系統(tǒng)[3],最終產(chǎn)生致畸、致突變和致癌等效應(yīng)。因此,世界各國已禁止β2-受體激動(dòng)劑作飼料添加劑。

目前,β2-受體激動(dòng)劑的主要確證方法是高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS/MS)[4-7]。液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜的定性能力強(qiáng)、定量測(cè)定靈敏度高,但在定量分析復(fù)雜樣品中的痕量化合物時(shí)易受樣品基質(zhì)的干擾,且通常情況下分析物響應(yīng)的抑制或增強(qiáng)會(huì)降低測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度[8-9]。本文參照 Lian Wang[10]的樣品酶解方法,即使用乙酸銨60℃酶解 2 h后提取豬肉、豬肝和魚肉樣品中的痕量沙丁胺醇、克倫特羅和特布他林方法,分別采用SN/T 1924-2007[6]和王鳳美[7]所使用的 C18-SCX串聯(lián)柱及 MCX固相萃取柱凈化,按照 Matuszewski等[11]建立的數(shù)學(xué)模型評(píng)定考察 LC-MS/MS測(cè)定這幾種β2-受體激動(dòng)劑的基質(zhì)效應(yīng),為定量方法的選擇提供參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 主要儀器

WatersQuattro Premier超高效液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國 Waters公司);R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BüCH I);KQ-600型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);XH-B型旋渦混勻器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);Z323K型離心機(jī) (德國,HERMLE);Silentcrusher M型高速勻質(zhì)器 (德國 Heidolph)。

2.1.2 主要試劑與材料

乙腈、甲醇均為 HPLC級(jí);乙酸銨為優(yōu)級(jí)純;沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和特布他林標(biāo)準(zhǔn)樣品:純度大于 99.0%,均購于德國 Dr.公司;其余化學(xué)試劑均為分析純;β-鹽酸葡萄糖醛苷酶 -芳基硫酸酯酶混合溶液:購于 Sigma公司,混合液中含β-鹽酸葡萄糖醛苷酶 94400U/mL,芳基硫酸酯酶 1079U/mL。MCX固相萃取柱:Waters Oasis,3mL,60 mg;C18固相萃取柱:SUPELCO,3mL,500 mg;SCX固相萃取柱:SUPELCO,3mL,500 mg。

2.2 方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱取適量沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和特布他林用甲醇溶解,配制成濃度為100μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成 2-100.0ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.2 液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex-C182.1(i.d)×100 mm(2.6μm);

1)這次暴雨天氣是南下的弱冷空氣與副熱帶高壓西北側(cè)的暖濕空氣在長江中下游交匯造成的;低空急流為暴雨輸送水汽和能量,切變線為對(duì)流的發(fā)展提供低層輻合上升條件。

流動(dòng)相:乙腈 +5mmol/L乙酸銨緩沖液 (含0.2%甲酸);

流速:0.2mL/min;

進(jìn)樣體積:10μL;

電離方式:ESI+;毛細(xì)管電壓:3.5 kV;離子源溫度:110℃,脫溶劑氣溫度:400℃;錐孔氣流量(N2):50 L/h,脫溶劑氣流量 (N2):600L/h,碰撞室壓力 (Ar):3.6e-3(mbar),碰撞氣流量 (Ar):0.3 mL/min。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間見表 1。

表 1 待測(cè)物定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間

2.2.3 樣品處理

2.2.3.1 樣品提取

同時(shí)準(zhǔn)確稱取 5份勻漿后不含待測(cè)物沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和特布他林的樣品 (豬肉、魚肉及豬肝)10.0g,參照 LianWang[10]的樣品酶解方法,即分別加入 20.0mL 2.0 mol/L乙酸銨緩沖溶液 (pH 5.2),高速勻質(zhì) 2 min。加入 50μLβ-鹽酸葡萄糖醛苷酶 -芳基硫酸酯酶混合溶液,超聲提取 15 min。在 60℃恒溫箱中酶解 2 h后,以 3000 r/min離心 10 min。上清液分別作為MCX和 C18-SCX柱的待凈化液。

2.2.3.2 樣品凈化

2.2.3.2.1 MCX柱凈化

(1)依次采用 3mL甲醇、3mL水活化 MCX小柱,移取上待凈化液 2.5mL,以 1滴 /s的流速全部通過MCX小柱,然后用 3mL水、3mL甲醇水 (1+1)進(jìn)行淋洗,最后用 5mL 5%的氨化甲醇洗脫。

(2)洗脫液于 40℃下氮?dú)鉂饪s吹干后,用 0.5mL濃度為 2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液定容,供 UPLC-MS/MS進(jìn)行提取后添加法基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試。

2.2.3.2.2 C18-SCX串聯(lián)柱凈化

(1)將 C18和 SCX小柱串聯(lián),SCX小柱在下,依次用 5mL水、5mL甲醇及 5mL 0.03 mol/L鹽酸活化,移取上待凈化液 2.5mL,以 1滴 /s的流速全部通過小柱,然后用 5mL水,5mL甲醇淋洗,最后用12mL乙酸乙酯氨水 (97+3)溶液洗脫。

(2)洗脫液于 40℃下氮?dú)鉂饪s吹干后,用0.5mL濃度為 2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液定容,供UPLC-MS/MS進(jìn)行提取后添加法基質(zhì)效應(yīng)測(cè)試。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法

按照Matuszewski等[11]建立的數(shù)學(xué)模型評(píng)定基質(zhì)效應(yīng)的影響。采用提取后添加法,比較 2個(gè)不同條件下的信號(hào)峰面積平均值,其中 Sl為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜峰面積,S2為動(dòng)物源性樣品基質(zhì)提取后添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積,則絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)(ME%)=S2/Sl×100%。當(dāng) ME為 100%時(shí),表明沒有絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)ME ＞100%時(shí),表明有信號(hào)增強(qiáng);當(dāng)ME ＜100%時(shí),表明有信號(hào)抑制。

3 結(jié)果與討論

基質(zhì)是樣品中被分析物以外的組分,常對(duì)分析物的分析有顯著干擾 (信號(hào)增強(qiáng)或抑制),這種影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)。LC-MS/MS普遍存在基質(zhì)效應(yīng)[12],基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和精密度,甚至認(rèn)為[13]基質(zhì)效應(yīng)已成為液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜的“致命”缺點(diǎn)。目前對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的確切機(jī)理還不太清楚,但大都認(rèn)為是由于分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率。Cech[14]、King[15]等研究認(rèn)為,基質(zhì)效應(yīng)由形成帶電霧滴時(shí)非揮發(fā)性的基質(zhì)組分與分析物離子競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生的,這些非揮發(fā)性基質(zhì)組分將霧滴牢牢吸在一起,阻止其分裂成更小的微滴。因此,在用 LC-MS/MS測(cè)定時(shí)需要考察和消除基質(zhì)效應(yīng)[17]。一些分析工作者提出了使用基質(zhì)匹配溶液、同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)溶液、優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件和改進(jìn)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析條件等[18]解決基質(zhì)效應(yīng)的許多方法。但是,使用基質(zhì)匹配溶液在操作上非常麻煩,前處理工作量大;同位素內(nèi)標(biāo)雖可抵消質(zhì)譜離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)和消除樣品前處理中的差異,但標(biāo)記物價(jià)格昂貴且不易獲取,在一般實(shí)驗(yàn)室很難作為常用方法,且在同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分析物時(shí)很難抵消基質(zhì)效應(yīng),造成定量結(jié)果出現(xiàn)偏差。因此,優(yōu)化樣品前處理方法、純化樣品、盡可能地減少最終提取液中的基質(zhì)成分是消除基質(zhì)效應(yīng)最為有效和徹底的方法。

3.1 MCX柱凈化后的基質(zhì)效應(yīng)

圖 1是魚肉、豬肉和豬肝樣品酶解提取液經(jīng)MCX柱凈化后,UPLC-MS/MS測(cè)定 CL、SAL和 TE時(shí)的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng),可以看出,3種組織樣品都存在較強(qiáng)的信號(hào)抑制,并且對(duì) CL、SAL和 TE 3種目標(biāo)物的信號(hào)抑制順序均為:豬肝 ＞魚肉 ＞豬肉。3種目標(biāo)物中以 CL的信號(hào)抑制最強(qiáng),對(duì) TE和 SAL的信號(hào)抑制差異不明顯。

圖 1 MCX柱凈化后的基質(zhì)效應(yīng)

3.2 C18-SCX串聯(lián)柱凈化后的基質(zhì)效應(yīng)

圖 2是魚肉、豬肉和豬肝樣品酶解提取液經(jīng) C18-SCX串聯(lián)柱凈化后,UPLC-MS/MS測(cè)定 CL、SAL和 TE時(shí)的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng),可以看出,3種樣品都存在信號(hào)抑制。對(duì)于具體檢測(cè)目標(biāo)物,CL的信號(hào)抑制最強(qiáng),TE的信號(hào)抑制相對(duì)較小。而對(duì)于組織樣品,以魚肉的信號(hào)抑制增強(qiáng),其次是豬肉和豬肝。SAL和 TE 3種物質(zhì)的信號(hào)抑制順序相同 (魚肉 ＞豬肉 ＞豬肝)。

圖 2 C18-SCX串聯(lián)柱凈化后的基質(zhì)效應(yīng)

3.3 兩種凈化方法的基質(zhì)效應(yīng)比較及原因分析

由圖 1圖 2可知,采用 C18-SCX串聯(lián)柱凈化方法的基質(zhì)效應(yīng)要明顯小于MCX凈化方法,特別是對(duì)于目標(biāo)物特布他林和沙丁胺醇,而對(duì)于克倫特羅,兩種凈化方法的差異不明顯。對(duì)于具體組織樣品,兩種凈化方法的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)也不一樣,豬肝樣品采用MCX凈化的信號(hào)抑制最強(qiáng),而魚肉樣品采用C18-SCX串聯(lián)柱凈化的信號(hào)抑制最強(qiáng)。產(chǎn)生差異的原因在于:根據(jù) Antignac[19]等的研究,引起基質(zhì)效應(yīng)的干擾物質(zhì)分為“內(nèi)源性抑制”和“外源性抑制”物質(zhì),內(nèi)源性抑制物質(zhì)主要是指本來存在于樣品基質(zhì)中,而經(jīng)過提取后仍然存在于提取物中,包括鹽、高極性化合物、表面活性劑、有機(jī)分子如各種糖類、胺類、脂類、肽類,或與分析目標(biāo)物化學(xué)結(jié)構(gòu)接近的代謝產(chǎn)物;外源性抑制主要是指由樣品制備及色譜分析過程中引入的干擾物,如塑料和聚合物的殘留、鄰苯二甲酸鹽、離子對(duì)試劑、有機(jī)酸、緩沖液、SPE柱材料、流動(dòng)相等,由于豬肝、豬肉及魚肉樣品中的有機(jī)化合物如糖類、胺類、脂肪等含量有較大差異,同時(shí) SCX屬于強(qiáng)陽離子凈化材料,而 MCX為混合陽離子凈化材料,因此對(duì)樣品中干擾物的去除能力也不一樣。

4 結(jié)論

綜上,對(duì)于同一檢測(cè)目標(biāo)物,采用不同的凈化方法,其在UPLC-MS/MS檢測(cè)中所表現(xiàn)的基質(zhì)效應(yīng)完全不同。采用目前標(biāo)準(zhǔn)方法及文獻(xiàn)報(bào)道的MCX和 C18-SCX串聯(lián)柱 SPE柱凈化,均不能消除UPLC-MS/MS測(cè)定克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林的基質(zhì)效應(yīng),均存在較強(qiáng)的信號(hào)抑制。從提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性來看,兩種凈化方法均不能消除基質(zhì)效應(yīng)。因此,在樣品定量時(shí)需要采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液或同位素內(nèi)標(biāo)及其他凈化手段來消除基質(zhì)效應(yīng)。

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