華溪蟹主要組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立

武陽(yáng)，馬文麗，王蘭

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

華溪蟹主要組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立

武陽(yáng)，馬文麗，王蘭*

（山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

為深入研究重金屬脅迫下華溪蟹主要組織蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，對(duì)華溪蟹心臟及鰓總蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)體系進(jìn)行了初步探討.通過(guò)對(duì)樣品處理方法、上樣量大小以及雙向電泳實(shí)驗(yàn)條件的比較選擇，初步建立了適用于華溪蟹組織蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)體系.結(jié)果表明：選取p H 3～10的24 cmIPG膠條，上樣量1.0 mg，得到了較為理想的華溪蟹心臟及鰓雙向電泳圖譜；分離到的心臟蛋白質(zhì)多集中于p H 5.5～9，而鰓蛋白質(zhì)多集中于p H 4～7.

蛋白質(zhì)組；華溪蟹；雙向電泳；心臟；鰓

蟹類(lèi)是低等指示生物在水體環(huán)境中代表性的物種，生活于水體基底層，直接面對(duì)沉積于水體中的金屬離子，適于作為檢測(cè)水體重金屬污染的指示生物［1］.河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）是我國(guó)特有的淡水蟹種類(lèi)，分布廣泛，易采易養(yǎng)，是一種較好的模式生物.

進(jìn)入后基因組時(shí)代，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成為生命科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)［2］.利用蛋白質(zhì)組學(xué)可以大規(guī)模研究一種組織乃至生物的蛋白質(zhì)特征，研究蛋白質(zhì)的翻譯、修飾、表達(dá)機(jī)理及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的相互作用［3］，而它的發(fā)展卻受到技術(shù)條件的限制，在實(shí)際研究過(guò)程中，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)難于基因組學(xué)的研究技術(shù)，需要通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索.

雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為基本和重要的技術(shù)［4-5］.GE Healthcare公司的 Multiphor II雙向電泳系統(tǒng)是目前使用最廣泛、發(fā)展最成熟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái).本實(shí)驗(yàn)采用此套雙向電泳系統(tǒng)，對(duì)華溪蟹心臟及鰓組織的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)進(jìn)行了摸索，初步建立了適用于華溪蟹組織蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)體系，為華溪蟹不同組織蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

河南華溪蟹購(gòu)自太原市五龍口水產(chǎn)市場(chǎng)，置實(shí)驗(yàn)室水族缸（130 cm×50 cm×60 cm）中暫養(yǎng)兩周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).暫養(yǎng)期間每隔2 d喂食1次.實(shí)驗(yàn)時(shí)用鑷子將溪蟹從缸中取出，用去離子水沖洗干凈，電子天平稱(chēng)重后在解剖盤(pán)中解剖，小心取出心臟及鰓等組織備用.

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

Multiphor II雙向電泳系統(tǒng)，包括Ettan IPGphor 3等電聚焦系統(tǒng)、Ettan DALT six大規(guī)模垂直電泳系統(tǒng)及Image Scanner掃描儀（GE Healthcare）；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）.

1.2.2 主要試劑

24 cm、p H 3～10 IPG預(yù)制膠條、礦物油、Pharmalyte p H 3～10載體兩性電解質(zhì)、CHAPS、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素、硫脲、碘乙酰胺均購(gòu)自GE公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；硝酸銀、甲醇、甲醛、碳酸鈉、過(guò)硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、蔗糖、甘油、甘氨酸、溴酚藍(lán)為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭慌Ｑ灏椎鞍祝˙SA）為國(guó)產(chǎn)生物技術(shù)純?cè)噭?

1.2.3 主要溶液

裂解液：4.985 g尿素，1.52 g硫脲，0.1 g DTT（臨用加入），0.2 g CHAPS，200μL IPG buffer（3-10），加入超純水至總體積10 m L.

水化液：8.41 g尿素，3.04 g硫脲，0.046 g DTT（臨用加入），0.4 g CHAPS，100μL IPG buffer（3-10），加入超純水至總體積20 m L.

平衡緩沖液：72 g尿素，47.54 m L甘油，4 gSDS，6.68 m L分離膠緩沖液，0.004 g溴酚藍(lán)，加入超純水至總體積200 m L.

平衡液Ⅰ：使用前每10 m L平衡緩沖液中加入100 mgDTT（臨用時(shí)配制）.平衡液Ⅱ：使用前每10 m L平衡緩沖液加入400 mg碘乙酰胺（臨用時(shí)配制）.

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與蛋白定量

取新鮮組織（心臟、鰓）1 g，加入5 m L裂解液，勻漿器勻漿，4℃，12 000 r／min離心20 min.取上清液，加入2倍體積的丙酮（內(nèi)含0.07%（V／V）的β-巰基乙醇，-20℃預(yù)冷），放置30 min，4℃，15 000 r／min離心20 min.棄上清，用-20℃預(yù)冷丙酮洗滌沉淀，室溫干燥，最后用水化液1 m L溶解沉淀，4℃，12 000 r／min離心20 min，上清液即為樣品溶液.操作過(guò)程中應(yīng)盡量保持低溫，以防止蛋白質(zhì)降解.取部分樣品，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度.

1.3.2 水化上樣與第一向等電聚焦電泳

實(shí)驗(yàn)采用24 cm的IPG膠條.在膠條槽中加入水化液450μL，按總蛋白量1.0 mg加入樣品溶液，加入適量溴酚藍(lán)染液.取出膠條從酸性端（標(biāo)“＋”端）剝?nèi)PG保護(hù)膜，膠面朝下，將膠條陽(yáng)極放入膠條槽對(duì)應(yīng)位置，使其接觸水化液，繼續(xù)放下膠條，使水化液全部浸潤(rùn)整個(gè)膠條并保證膠條的兩端與槽兩端的電極接觸良好.放好膠條后，用膠頭滴管覆蓋足量的覆蓋油.蓋好膠條蓋，放入Ettan IPGphor 3中進(jìn)行第一向等電聚焦電泳.第一向的等電聚焦條件：（1）60 V，10 h（2）200 V，2 h（3）500 V，1 h（4）1 000 V，2 h（5）5 000 V，1 h（6）10 000 V，3 h（7）10 000 V，55 000 Vh（8）1 000 V，10 h.膠條限流為：50μA／條，電泳大約24 h.

1.3.3 IPG 膠條的平衡

第一向電泳完成后，用鑷子取出膠條放入塑料管中進(jìn)行平衡.倒入適量平衡液Ⅰ（漫過(guò)膠面一些距離即可），放在脫色搖床上振蕩15 min.倒掉平衡緩沖液I，加入適量平衡緩沖液II，繼續(xù)振蕩15 min，取出膠條，做下一步使用.

第一步平衡在平衡液中加入DTT，是為了使變性的非烷基化的蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)；第二步平衡中加入碘乙酰胺，是為了使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止它們?cè)陔娪具^(guò)程中重新氧化，碘乙酰胺還能使殘留的DTT烷基化.

1.3.4 第二向SDS-PAGE電泳

配制10%的均一分離膠，在Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)中灌膠并加水覆蓋，將平衡后的IPG膠條在電泳緩沖液中潤(rùn)濕后，直接轉(zhuǎn)移至分離膠頂端.膠條支持膜一側(cè)貼玻璃面，排出膠條與玻璃面之間的氣泡.用0.15%瓊脂糖封閉凝膠.電泳槽中灌注電泳緩沖液，4℃電泳.電泳參數(shù)為80 V，1 h；240 V，4 h.當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠底部時(shí)結(jié)束電泳.

1.3.5 染色

采用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色.按照GE儀器操作手冊(cè)中銀染法配制固定液、敏化液、銀染液、顯色液、終止液，染色步驟同樣按操作手冊(cè)進(jìn)行.

1.3.6 凝膠掃描及分析

用Image Scanner掃描儀對(duì)染色后的凝膠進(jìn)行掃描，并利用Image Master 2D Platinum 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析.

2 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)樣品處理方法、上樣量大小以及雙向電泳實(shí)驗(yàn)條件的摸索，選取p H 3～10的24 cm IPG膠條，上樣量1.0 mg（以總蛋白量計(jì)），得到了較為理想的華溪蟹心臟雙向電泳圖譜（圖1）.分離出的心臟蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)量豐富，邊界清晰，大部分蛋白點(diǎn)集中于p H 5.5～9，在酸性端檢測(cè)到的蛋白質(zhì)較少.電泳圖譜基本上沒(méi)有縱向拖尾，但呈現(xiàn)輕微的橫向紋理，應(yīng)該是第一向聚焦不完全所致，還需在等電聚焦實(shí)驗(yàn)流程方面進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn).

圖2為獲得的華溪蟹鰓蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.結(jié)果顯示，與心臟蛋白質(zhì)分布范圍明顯不同，分離到的華溪蟹鰓蛋白質(zhì)多集中在p H 4～7，堿性端檢測(cè)到的很少.在p H 5～7內(nèi)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)邊界清晰，沒(méi)有橫紋與拖尾，而在偏酸性端p H 4～5范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分布十分緊密，有明顯的縱向拖尾現(xiàn)象，還需在蛋白質(zhì)樣品的提取及處理方面繼續(xù)摸索優(yōu)化.

圖1 華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.1 2DE-PAGE patterns of proteins extracted from heart of S.henanense

圖2 華溪蟹鰓蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.2 2DE-PAGE patterns of proteins extracted from gill of S.henanense

3 討論

3.1 上樣量的選擇

上樣量在雙向電泳中起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用，它的大小取決于膠條的長(zhǎng)度、p H范圍以及染色方法等.使用較大上樣量會(huì)使產(chǎn)生的蛋白斑點(diǎn)不易分離，點(diǎn)顯得雜亂；而上樣量太小，會(huì)遺失很多低豐度蛋白，從而使電泳圖像中的點(diǎn)很少［6］.要得到一個(gè)比較好的結(jié)果，需要在實(shí)驗(yàn)中不斷摸索，找到最適合的上樣量.

實(shí)驗(yàn)中對(duì)上樣量進(jìn)行了摸索.第一次使用了GE手冊(cè)推薦的上樣量200μg總蛋白進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，銀染后發(fā)現(xiàn)在圖譜上按預(yù)期出現(xiàn)了一些較清晰的點(diǎn)，但出現(xiàn)的點(diǎn)很少，達(dá)不到蛋白質(zhì)組的要求.因此，又使用更大的上樣量1 mg總蛋白，獲得了較為理想的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)豐富清晰的華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.而鰓因成分更復(fù)雜，在偏酸性的p H 4～5內(nèi)，電泳圖譜不盡理想，還需進(jìn)一步改進(jìn)樣品處理方法及摸索更適合的上樣量.因此我們認(rèn)為對(duì)于銀染法而言，GE儀器手冊(cè)推薦的200μg的上樣量是偏低的，應(yīng)該在600μg～1 mg.

3.2 樣品處理

樣品處理是雙向電泳的關(guān)鍵步驟，它直接關(guān)系到雙向電泳的準(zhǔn)確性和靈敏性.雙向電泳對(duì)實(shí)驗(yàn)中樣品蛋白質(zhì)純度的要求相當(dāng)高.因此選擇一種較先進(jìn)的方法對(duì)樣品進(jìn)行提純處理，得到除蛋白質(zhì)外基本不含其他物質(zhì)的樣品，是決定雙向電泳是否成功的很關(guān)鍵的一步［7］.

本實(shí)驗(yàn)我們采用了一種較常規(guī)的方式進(jìn)行樣品處理.首先采用玻璃勻漿器對(duì)組織進(jìn)行了勻漿破碎，然后用冰丙酮對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了多次沉淀洗滌.結(jié)果顯示，這種處理方法對(duì)心臟十分適宜，獲得了斑點(diǎn)豐富清晰的華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜.而對(duì)于鰓而言，因富含酸性蛋白質(zhì)，還需進(jìn)一步優(yōu)化樣品處理方法.

3.3 等電聚焦程序

合理的等電聚焦程序也是獲得高分辨率圖譜的基礎(chǔ)，對(duì)凝膠圖譜上的橫紋有直接的影響［8］.我們選擇了GE儀器手冊(cè)推薦的常規(guī)程序：（1）60 V，10 h（2）200 V，2 h（3）500 V，1 h（4）1 000 V，2 h（5）5 000 V，1 h（6）10 000 V，3 h（7）10 000 V，55 000 Vh（8）1 000 V，10 h，結(jié)果在24 h內(nèi)順利達(dá)到電流為0的聚焦效果.但我們觀察到，在整個(gè)聚焦電泳過(guò)程中，電泳電壓并未完全按照我們所設(shè)定的步驟工作，電壓的走勢(shì)是線(xiàn)性的，有利于達(dá)到更好的電泳效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，華溪蟹心臟蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜有輕微的橫紋現(xiàn)象，可以通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)除鹽時(shí)間來(lái)改善.

3.4 染色方法

目前雙向電泳主要使用銀染和考馬斯亮藍(lán)染色兩種方法.就分辨率而言，銀染是考染的100倍，靈敏度明顯優(yōu)于考染；銀染上樣量只需幾百微克，考染需要毫克級(jí)，但在操作上銀染復(fù)雜得多［9-10］.由于很高的靈敏度，整個(gè)染色過(guò)程要保證所有染色器皿、染色試劑絕對(duì)干凈，稍有不慎即會(huì)造成染色背景過(guò)深，影響電泳圖譜質(zhì)量.另外，銀染中顯色步驟也很關(guān)鍵，顯色時(shí)間不足會(huì)造成蛋白質(zhì)斑點(diǎn)丟失，而顯色過(guò)度會(huì)導(dǎo)致膠面變黑，圖譜背景過(guò)深，不易觀察.

3.5 雙向電泳中的試劑

雙向電泳因?yàn)殪`敏度高，對(duì)試劑的要求特別高，要求達(dá)到優(yōu)級(jí)純.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的水必須是超純水，所有溶液必須進(jìn)行0.22微米微孔濾膜過(guò)濾［9-10］.由于實(shí)驗(yàn)條件所限，銀染過(guò)程中一些試劑如硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、甲醇我們使用了國(guó)產(chǎn)分析純藥品，對(duì)圖譜產(chǎn)生了背景過(guò)深的影響.

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Establishment of 2-DE Technique in Heart and Gill Proteome ofSinopotamonhenanense

WU Yang，MA Wen-li，WANG Lan
（SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006，China）

In order to research the differential expression of proteome in tissues of freshwater crabSinopotamonhenanenseinduced by heavy metals，the 2-DE（two-dimensional electrophoresis）related techniques for heart and gill proteome ofS.henanensewere studied.By comparative tests between different extraction methods，sample volume and isoelectric focusing programs，a tentative 2-DE method which suited for the separation of tissue proteome ofS.henanensewas established.The results showed that with 24 cm，p H 3～10 IPG strips and 1.0mg sample protein，relatively ideal 2-DE patterns in heart and gill proteome ofS.henanensewere successfully separated，heart proteins mainly distributed in the p H 5.5～9 range，whereas gill proteins mainly distributed in the p H 4～7 range.This study will set up the foundation for further research on proteomics ofS.henanense.

proteome；Sinopotamonhenanense；two-dimensional gel electrophoresis；heart；gills

Q-503

A

0253-2395（2011）S2-0108-04

2011-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（30970361）；山西省自然科學(xué)基金（2010011043-2）

武陽(yáng)（1986-），男，山西太原人，碩士研究生，主要研究華溪蟹金屬硫蛋白的表達(dá)及生物功能.E-mail：wus611＠gmail.com.*通訊作者，E-mail：lanwang＠sxu.edu.cn