RP-HPLC法測定超臨界提取物中淫羊藿苷的含量

關(guān)雅瓊，張曜武，張龍，牛曉麗

（青島科技大學(xué)工學(xué)院藥學(xué)系，山東青島266042）

RP-HPLC法測定超臨界提取物中淫羊藿苷的含量

關(guān)雅瓊，張曜武，張龍，牛曉麗

（青島科技大學(xué)工學(xué)院藥學(xué)系，山東青島266042）

目的：建立淫羊藿葉超臨界提取物中淫羊藿苷的含量測定方法。方法：采用RP-HPLC法，Hypersil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-0.1%冰醋酸水溶液梯度洗脫，流速1 mL·min-1，檢測波長270 nm。結(jié)果：淫羊藿苷在0.212～2.12 μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率98.7%，RSD為1.18%（n=6）。結(jié)論：該法簡便、易操作，適用于淫羊藿超臨界提取物中淫羊藿苷的含量測定，可有效地控制淫羊藿超臨界提取物的質(zhì)量。

淫羊藿；淫羊藿苷；超臨界提取物；高效液相；含量測定

本實(shí)驗(yàn)旨在對淫羊藿CO2超臨界流體萃取物的研究中，建立準(zhǔn)確，快速，靈敏的質(zhì)量控制方法，以期更有效的開發(fā)利用這一天然藥物資源。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

doiNEX高效液相色譜儀（配有PDA-3000光電二極管矩陣檢測器，P-3400A分析泵），Chromeleon色譜工作站；HA221-50-06型超臨界萃取裝置（江蘇南通華安公司）；FA1004N型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限有限公司）；KQ-100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品自中國藥品生物制品檢定所購買；淫羊藿葉購自河南聚仁中藥飲片有限公司，批號20091115；甲醇為色譜純；水為超純水；其它試劑均為分析純；二氧化碳（99.95%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿超臨界提取物的薄層色譜鑒別

2.1.1供試品溶液的制備

取淫羊藿藥材粉末100 g裝于萃取釜，以CO2為溶劑，設(shè)定萃取釜、解析釜的溫度分別為60℃、25℃，壓力分別為30 MPa、6 MPa，進(jìn)行動態(tài)萃取2 h，得到萃取物，制得供試品溶液備用。

2.1.2 淫羊藿苷對照品溶液Ⅰ的制備

精密稱取淫羊藿苷對照品10.0 mg于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1.0 mg·mL-1的對照品溶液Ⅰ。

2.1.3 薄層鑒別

分別吸取上述供試品溶液、對照品溶液I，硅膠H板上點(diǎn)樣，以氯仿-甲醇-甲酸為展開劑，1%三氯化鋁乙醇溶液顯色，置紫外燈365 nm下檢視，供試品溶液在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，說明樣品中含有淫羊藿苷成分。

2.2 淫羊藿超臨界提取物的高效液相色譜檢測

2.2.1 色譜條件

本文參照有關(guān)文獻(xiàn)[5]，制定如下色譜條件，色譜柱:Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：流動相A（甲醇）和B（0.1%冰醋酸溶液）梯度洗脫0min，A30%，B70%；10min，A55%，B 45%；15 min，A 67%，B 33%；20 min，A 68%，B 32%；22 min，A 75%，B 25%。流速：1 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL，色譜圖見圖1。

2.2.2 色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按淫羊藿苷峰計(jì)算，色譜系統(tǒng)的理論塔板數(shù)為48 784;淫羊藿苷與其相鄰的色譜峰的分離度大于1.5，淫羊藿苷與相鄰的色譜峰可以完全分離。

2.2.3 淫羊藿苷對照品儲備液Ⅱ的制備

精密稱取淫羊藿苷對照品10.6mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為1.06 mg·mL-1的對照品儲備液Ⅱ。

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品儲備液Ⅱ0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL置于10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。按色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程:Y=48.838X+ 3.467 8，r=0.999 1。結(jié)果:淫羊藿苷在0.212～2.12 μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 樣品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

樣品溶液室溫放置，于8 h內(nèi)每間隔2 h測定淫羊藿苷的含量，RSD為0.99%，說明樣品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

按色譜條件測定，對0.010 6、0.063 6、0.106 mg·mL-13個質(zhì)量濃度分別進(jìn)樣3針，量取峰面積，計(jì)算RSD。高、中、低3個質(zhì)量濃度的RSD分別為1.17%、1.92%、1.59%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，測定方法的RSD值不大于1.92%。

2.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批淫羊藿藥材,按“2.1.1”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液,分別測定含量。淫羊藿苷含量測定結(jié)果的RSD為2.22%，表明分析方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批號已知含量的樣品6份，分別按其中淫羊藿苷含量的80%、100%、120%加入淫羊藿苷對照品，按樣品溶液的制備方法操作，分別進(jìn)樣，計(jì)算回收率。平均加樣回收率為98.7%，RSD為1.18%（n=6）。

2.3 淫羊藿超臨界萃取物的測定

分別按上述確定的方法制備樣品后測定淫羊藿苷的含量，3次測定結(jié)果得到淫羊藿苷在藥材中的平均含量為0.092 mg/g。

3 結(jié)論

3.1 比較圖b和圖c可以看出，超臨界流體萃取的選擇性較好，萃取物的淫羊藿苷含量較高，雜質(zhì)成分相對較少，有利于粗提物的進(jìn)一步精制。索氏提取樣品的雜質(zhì)相對較多，而且需要耗費(fèi)更多的有機(jī)溶劑和提取時(shí)間。超臨界萃取技術(shù)可以應(yīng)用于淫羊藿中淫羊藿苷的提取。

3.2 實(shí)驗(yàn)先后選擇甲醇-0.5%冰醋酸（60∶40）、甲醇-0.1%冰醋酸（60∶40），甲醇-0.1%冰醋酸(梯度洗脫)體系，從分離情況和出峰時(shí)間等綜合分析，選擇了甲醇-0.1%冰醋酸梯度洗脫，色譜條件穩(wěn)定。

3.3 超臨界CO2萃取技術(shù)在中藥提取中具有綠色環(huán)保等諸多優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)針對該技術(shù)提取的淫羊藿超臨界CO2萃取物，建立了高效液相色譜分析方法，具有較高的精密度，適用于檢測淫羊藿超臨界提取物中淫羊藿苷的含量，同時(shí)也為黃酮類成分的超臨界萃取物質(zhì)量控制提供參考。

［1］侯家玉.中藥藥理學(xué)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2002:235-237.

［2］李娌,王學(xué)美.淫羊藿苷藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志, 2008,33(23):2728-2731.

［3］張華峰,楊曉華.淫羊藿藥材質(zhì)量控制的問題與對策[J].中草藥, 2009,40(1):160-162.

［4］趙東勝,劉桂敏,吳兆亮.超臨界流體萃取技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].天津化工,2007,21(3):10-12.

［5］趙煥君,胡天蓉,張君.HPLC法測定參茸強(qiáng)腎膠囊中淫羊藿苷的含量[J].遼寧中醫(yī)雜志,2008,(7).

Determination of icariin in supercritical fluid extracts of epimedium by RP-HPLC

GUAN Ya-qiong,ZHANG Yao-wu,ZHANG Long,NIU Xiao-li
(Department of Pharmacy,College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology, Qingdao Shandong 266042,China)

Objective:To determine the content of icariin in supercritical fluid extracts of Epimedium by RPHPLC.Methods:The sample was separated on a C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)with the mobile phase of methanol-0.1%acetic acid in water solution as gradient eluent.The flow rate was 1 mL·min-1and the detection wavelength was set at 270 nm.Results:The calibration curve was linear in the range of 0.212～2.12 μg for icariin;The average recovery was 98.7%，RSD=1.18%（n=6).Conclusion:The method is rapid and accurate.It can be used as a method of quality control for supercritical fluid extracts of epimedium.

epimedium;icariin;supercritical fluid extracts;HPLC;content determination

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.03.019

R284

A

1008-1267（2011）03-0055-03

2010-11-24

關(guān)雅瓊（1985-），女，碩士研究生，研究方向：中藥制劑現(xiàn)代化。