髓核內(nèi)注射轉(zhuǎn)化生長因子-β1對兔軟骨終板Ⅱ型膠原表達影響的實驗研究

馬 驍，楊學軍，霍洪軍，卡 索，劉 成

腰痛是骨科及疼痛科門診中較常見的疾患。腰椎間盤退變是引起腰腿痛的主要原因，其確切的發(fā)生機制仍不十分清楚，但普遍認為軟骨終板退變是腰椎間盤退變的基礎環(huán)節(jié)［1］。本研究通過制作椎間失穩(wěn)導致軟骨終板退變的家兔模型，并通過髓核內(nèi)注射轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)抑制炎性因素作用等方法預防軟骨終板退變，為椎間盤退變的預防和早期治療提供新的思路和途徑。

材料與方法

1 動物及分組

選用36只6月齡日本大耳白兔(由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物實驗中學提供)，雌雄不限，體重為(2.5±0.2)kg，均在相同條件下飼養(yǎng)。隨機分為對照組和預防組。對照組18只(2只備用)，預防組18只(2只備用)。

2 方法

所有實驗動物的手術操作均由1個人完成，通過剝離骶棘肌、切斷L5/6、L6/7棘上、棘間韌帶、關節(jié)囊及兩側(cè)關節(jié)突關節(jié)后外1/2造成L5/6、L6/7椎間失穩(wěn)模型。預防組動物在完成椎間失穩(wěn)手術后立即于同一切口通過側(cè)后方入路顯露L5/6、L6/7椎間盤，并行髓核內(nèi)注射TGF-β1。

2.1 椎間失穩(wěn)手術:將全部實驗動物36只日本大耳白兔均行椎間失穩(wěn)手術，將其腰背部皮毛剪除至清潔，用安定注射液1.25mg/kg、氯胺酮0.02g/kg、阿托品0.125mg/kg順次耳緣靜脈注射麻醉后，俯臥固定于手術臺上，1%碘伏消毒手術區(qū)域，鋪無菌手術巾，以髂嵴平對椎間隙(即L6/7)為中心，從正中縱行切口長約4cm(預防組動物取正中偏左側(cè)弧形切口，長約6cm)，切開皮膚及皮下組織，銳性分離，暴露棘突、椎板及上下關節(jié)突，將附著于棘突、椎板及小關節(jié)的肌肉全部分離開，然后依次切除L5/6、L6/7棘上、棘間韌帶、關節(jié)囊，咬除L5、L6椎體下位后外1/2小關節(jié)突，造成椎間失穩(wěn)，用無菌生理鹽水沖洗切口，依次縫合各層組織。

2.2 側(cè)后方入路髓核內(nèi)注射:術前準備及麻醉同椎間失穩(wěn)手術。動物取右側(cè)臥位，以髂嵴平對椎間隙(即L6/7)為中心，取正中偏左側(cè)弧形切口長約6cm。切開胸腰筋膜后層，在骶棘肌和腰方肌的外緣與胸腰筋膜前層間鈍性分離。近腰方肌前內(nèi)緣可觸及橫突，剪斷L6左側(cè)橫突。剪開胸腰筋膜前層，可見腰大肌，用神經(jīng)剝離子縱行分開，即可顯露L6椎體和L5/6、L6/7椎間盤。椎間盤呈扁平盤狀，稍膨出，白色有光澤，用7號注射針頭穿刺確認椎間盤，用1ml注射器刺入纖維環(huán)，有突破感后(深度約5mm)注入 1mg/ml的 TGF-β125 ～30μl［2］。

術后動物均分籠飼養(yǎng)，籠中自由活動。對照組1只兔切口感染(3周后自然愈合);預防組1只兔深部感染(形成深部膿腫)，1只兔于術后第2天死亡。于術后第3、6個月各取8只取材。

2.3 檢測指標

標本進行蘇木精-伊紅(HE)染色進行組織學觀察。軟骨終板Ⅱ型膠原表達的測定采用常規(guī)免疫組化SP染色法，將免疫組化染色后的每個標本在高倍鏡下隨機選取不重疊10個視野，對每個視野中的Ⅱ型膠原進行灰度值檢測，用JD8Ol圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。根據(jù)不同染色部位的灰度值自動計算陽性細胞的平均灰度，以灰度值代表Ⅱ型膠原表達情況(灰度值與陽性物質(zhì)含量呈反比)。

2.4 統(tǒng)計學處理

分別對預防組與對照組術后3、6個月結(jié)果采用獨立樣本t檢驗處理，所有數(shù)據(jù)輸入計算機，以SPSS 15．0統(tǒng)計軟件分析，以P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 軟骨終板組織形態(tài)學觀察

對照組標本術后3、6個月軟骨終板退變明顯，并且逐漸加重。經(jīng)過髓核內(nèi)注射TGF-β1，預防組標本在術后3、6個月未發(fā)現(xiàn)軟骨終板明顯退變現(xiàn)象(圖1～4)。

2 對照組與預防組軟骨終板中Ⅱ型膠原的表達

高倍鏡下觀察，軟骨終板中Ⅱ型膠原呈棕色，顯色對照組標本術后3、6個月軟骨終板內(nèi)Ⅱ型膠原表達稀疏、排列欠均勻，并且逐漸加重。經(jīng)過髓核內(nèi)注射TGF-β1，預防組標本在術后3、6個月未發(fā)現(xiàn)軟骨終板內(nèi)Ⅱ型膠原表達較密集、排列緊密明顯減少(圖5～8)。

軟骨終板中Ⅱ型膠原的表達經(jīng)過髓核內(nèi)注射TGF-β1，椎間失穩(wěn)術后3、6個月預防組與對照組標本軟骨終板Ⅱ型膠原免疫組化染色圖像分析測定灰度值結(jié)果見表1。

表1 軟骨終板內(nèi)Ⅱ型膠原表達灰度值

軟骨終板中Ⅱ型膠原在對照組椎間失穩(wěn)狀態(tài)下各實驗時間點短期內(nèi)軟骨終板中Ⅱ型膠原含量明顯減少，變化是明顯的，統(tǒng)計學上有極顯著性差異(P＜0.05=0.000)。預防組自然增齡進程中各實驗時間點短期內(nèi)無明顯變化，統(tǒng)計學上無顯著性差異(P＞0.05=0.302)。術后3個月預防組與對照組比較灰度值較低，統(tǒng)計學上有顯著性差異(P＜0.05=0.044)。術后6個月預防組與對照組比較灰度值明顯較低，統(tǒng)計學上有極顯著性差異(P＜0.01=0.000)。

圖1 對照組術后3個月，少量簇聚的軟骨細胞，細胞排列不規(guī)則潮線不清(HE×40)

圖2 預防組術后3個月，軟骨細胞分布均勻，無簇聚軟骨細胞;潮線清晰;染色均勻(HE ×40)

圖3 對照組術后6個月，細胞排列紊亂，有大量簇聚軟骨細胞，軟骨鈣化層明顯增厚，潮線模糊、斷裂;染色不均勻(HE ×40)

圖4 預防組術后6個月，表層略不平整，軟骨細胞分布均勻，無簇聚軟骨細胞;潮線清晰;染色均勻(HE ×40)

圖5 對照組術后3個月，Ⅱ型膠原表達稀疏、排列欠均勻(免疫組化 ×100)

圖6 預防組術后3個月，Ⅱ型膠原表達較密集、排列緊密均勻(免疫組化×100)

圖7 對照組術后6個月，Ⅱ型膠原表達稀疏，有裂隙出現(xiàn)，排列不均勻，有失染現(xiàn)象(免疫組化 ×100)

圖8 預防組術后6個月，Ⅱ型膠原表達較密集、排列尚均勻(免疫組化 ×100)

討 論

1 軟骨終板退變在椎間盤退變中的作用

正常椎間盤由纖維環(huán)、髓核和軟骨終板組成。軟骨終板內(nèi)除軟骨細胞外還含豐富的細胞外基質(zhì)，主要包括水、膠原和蛋白多糖等。軟骨終板退變將導致3種主要物質(zhì)膠原、蛋白多糖和水的改變［3］。從力學上看，蛋白多糖能抵抗壓應力，而膠原能抵抗張應力［4］，兩者相互配合，以保持軟骨終板良好的力學性能。

軟骨終板是位于椎間盤與椎體之間一層薄的透明軟骨，平均厚度1mm。軟骨終板直接與椎體骨髓血竇接觸，椎間盤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運主要通過血竇－軟骨終板界面進行。因此軟骨終板途徑是椎間盤主要的營養(yǎng)途徑［5］。在椎間盤退變過程中，常伴隨著軟骨終板的損傷、增厚、鈣化或者骨化。隨著軟骨終板的增厚、鈣化及其骨化，血竇－軟骨終板界面彌散營養(yǎng)物質(zhì)的能力將受到嚴重影響，進一步導致椎間盤營養(yǎng)障礙，從而加重或加速椎間盤退變的發(fā)生，因此軟骨終板在椎間盤的營養(yǎng)代謝方面發(fā)揮著極其重要的作用。以上觀點已被許多臨床和實驗研究所證明［6］。

2 細胞因子對軟骨終板的作用

軟骨終板在生理狀態(tài)下，軟骨細胞的分解代謝和合成代謝處于平衡狀態(tài)，同時軟骨細胞的這種平衡狀態(tài)在維持成熟軟骨細胞外基質(zhì)結(jié)構和功能中也起到主要作用。這種分解與合成活動的平衡受到細胞因子的驅(qū)使。細胞因子由造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或炎癥反應中活化細胞產(chǎn)生一種激活型多功能多肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白。根據(jù)其調(diào)節(jié)軟骨細胞的不同功能可分為:分解性細胞因子、調(diào)節(jié)性細胞因子、抑制性細胞因子和合成性細胞因子。細胞因子發(fā)揮著調(diào)節(jié)細胞分化增值和誘導細胞發(fā)揮功能的作用，是調(diào)節(jié)細胞之間相互作用的主要因子。

本實驗討論的TGF-β1屬于合成性細胞因子，能抵消許多白細胞介素-1(IL-1)的影響，在軟骨維持及軟骨損傷修復中起重要作用。IL-1通過刺激軟骨細胞可以產(chǎn)生包括能破壞軟骨的大多數(shù)蛋白水解酶，如刺激組織金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)產(chǎn)生，抑制組織金屬蛋白酶(tissue inhibitor of metalloproteinas．es，TIMP)產(chǎn)生，導致 MMPs和TIMP比例失調(diào)，最終引起軟骨細胞外基質(zhì)破壞。TGF-β1具有對抗IL-1對軟骨細胞產(chǎn)生上述影響的作用，同時未發(fā)現(xiàn)其協(xié)同作用。因此，TGF-β1用于維持和修復損傷軟骨逐漸成為研究熱點。

3 側(cè)后方入路椎間盤內(nèi)注射方法的優(yōu)點

關于抑制和治療椎間盤退變的給藥途徑主要包括局部給藥、腹腔給藥等，腹腔給藥經(jīng)大網(wǎng)膜吸收后經(jīng)肝、腎等器官代謝，同時椎間盤是一個密閉系統(tǒng)，幾乎無血管供應，軟骨終板的被動擴散是其主要營養(yǎng)途徑，所以局部直接注射已成為首選的給藥途徑。既往椎間盤內(nèi)注射主要通過前側(cè)入路，由于兔和人解剖學特點的差別，很難完整剝離沿腹膜后顯露椎體及椎間盤。同時前側(cè)入路創(chuàng)傷大，對腹腔臟器干擾大，動物無法有效進行胃腸的術前準備和術后護理，術后并發(fā)癥較多，影響實驗效果。南方醫(yī)科大學王非等［2］于2003年提出側(cè)方入路于骶棘肌和腹斜肌間顯露椎間盤注射的方法，有效避免了上述情況的發(fā)生。本次實驗，由于實驗動物需行椎間失穩(wěn)手術，我們改良了側(cè)方入路椎間盤注射的方法，采取側(cè)后方弧型切口，完成椎間失穩(wěn)手術后，于同一切口經(jīng)后外側(cè)切開腰背筋膜后層，經(jīng)骶棘肌和腰方肌的外緣與胸腰筋膜前層間鈍性分離至L6橫突，剪斷L6左側(cè)橫突，縱行分開腰大肌后可顯露 L6椎體和L5/6、L6/7椎間盤。經(jīng)過側(cè)后方入路椎間盤注射的方法不僅避免損傷腹腔臟器，而且經(jīng)過髂嵴橫突可準確定位腰椎節(jié)段，顯露L5、L6椎體和 L5/6、L6/7椎間盤充分;操作簡便，普通器械可完成;損傷較小，且可于椎間失穩(wěn)造模術共用同一切口，避免再次創(chuàng)傷的優(yōu)點。側(cè)后方弧形切口定位顯露1～2個椎體及椎間盤較為方便有效，但如果需要一次性顯露3個或3個以上椎體及椎間盤，采取側(cè)方入路可能更為有效。

4 TGF-β與軟骨組織維持的相關性

軟骨終板屬透明軟骨，軟骨細胞必須終生維持未分化的狀態(tài)并保持良好的胞外基質(zhì)分泌功能才能保證脊柱的正常生理功能。軟骨終板還必須抵御各種各樣的損傷因素，如壓力、創(chuàng)傷、炎癥、異常代謝等，并自身調(diào)整建立新的平衡，維持軟骨的未分化狀態(tài)，否則將導致軟骨的消耗、侵蝕、鈣化，進一步限制營養(yǎng)物質(zhì)的交換，導致椎間盤等退變［7］。

TGF-β信號對于維持軟骨終板具有很重要的作用。TGF-β信號與軟骨細胞的發(fā)育成熟密切相關［8］，同時能維持軟骨細胞處于未分化狀態(tài)，抑制肥大分化。TGF-β的表達和功能隨著年齡在關節(jié)、終板軟骨中逐漸衰退［9］。另有實驗發(fā)現(xiàn)IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)這些炎癥細胞因子能抑制關節(jié)軟骨細胞中TGF-β信號的功能，TGF-β1的應用則可以對抗IL-1誘發(fā)的軟骨損傷，提示TGF-β信號在骨關節(jié)炎癥疾病進程中的聯(lián)系［10］。TGF-β1還可通過抑制可降解軟骨基質(zhì)的各類組織蛋白酶的表達來保護軟骨，如可通過細胞磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路誘導TIMP的表達來抑制關節(jié)軟骨的降解［11］。這些都有可能是TGF-β信號維持關節(jié)及終板軟骨未分化狀態(tài)的機制。TGF-β1分子作為藥物治療人類由于軟骨退變造成的一系列疾病已成為新的研究方向［12］。

本實驗顯示，隨著造模時間的延長，由于長期椎間失穩(wěn)的異常應力負荷，對照組動物軟骨終板內(nèi)Ⅱ型膠原消耗，軟骨細胞排列紊亂，部分細胞核固縮、碎裂、溶解，軟骨鈣化層增厚導致軟骨終板明顯退變。而預防組動物由于椎間失穩(wěn)造模同時行髓核內(nèi)注射TGF-β1，術后3、6個月軟骨終板組織學表現(xiàn)及軟骨內(nèi)Ⅱ型膠原表達情況均明顯優(yōu)于對照組動物。提示TGF-β1在椎間失穩(wěn)的異常應力負荷作用時可預防軟骨終板鈣化、退變，從而保障椎間盤的營養(yǎng)代謝，延緩椎間盤退變。本實驗雖然顯示了TGF-β1軟骨終板退變的預防作用，但不可否認，個別標本顯示對軟骨終板退變預防作用并不十分明顯，這可能由于椎間失穩(wěn)后，脊柱的異常負荷長期存在，雖然髓核內(nèi)注射TGF-β1可預防軟骨終板退變，但由于致病因素長期存在，我們采用的注射劑量及給藥時機、途徑也只是一種嘗試性的研究，更詳細、更有針對性的研究將繼續(xù)進行。

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