貨架期內(nèi)酸乳益生菌菌數(shù)與酸度變化研究

朱麗云，張擁軍，高永生，閔越雙，楊連陽

(中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

貨架期內(nèi)酸乳益生菌菌數(shù)與酸度變化研究

朱麗云，張擁軍，高永生，閔越雙，楊連陽

(中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018)

對貨架期內(nèi)酸乳益生菌菌數(shù)及酸度變化進(jìn)行分析，為合理的儲藏和飲用提供理論依據(jù)。采用MRS和MC培養(yǎng)基對益生菌進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，通過菌落形態(tài)特征和生化反應(yīng)結(jié)果對酸乳中德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌分別進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果酸乳中益生菌總菌數(shù)及雙歧桿菌在10 d內(nèi)4℃下存放比常溫存放降低速度慢一個數(shù)量級，與存放期間益生菌活動導(dǎo)致酸度增加存在密切關(guān)系。

益生菌；酸度；計數(shù)

0 引言

益生菌對機體具有其它腸道菌群不可替代的生理調(diào)節(jié)作用[1，2]。其主要功效為調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡,改善自然免疫功能(抑制癌癥細(xì)胞)，供應(yīng)氨基酸及維生素B群，降血脂、血壓等作用，但乳酸菌活菌體需達(dá)到一定數(shù)量才能發(fā)揮作用[3，4]。目前市場上銷售的酵奶制品,主要是由雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等共同發(fā)酵而成的，產(chǎn)品在儲藏過程中溫度等條件的不同,會導(dǎo)致酸乳中益生菌數(shù)量及酸度的變化,影響產(chǎn)品風(fēng)味降低感官質(zhì)量[5]。對酸乳在貯存過程中的菌數(shù)及酸度變化進(jìn)行測定,研究其變化規(guī)律,可以為有效延長酸乳保質(zhì)期提供理論依據(jù),從根本上解決酸乳的后酸化問題，為制定合適的貯存和銷售條件及確定商品的保質(zhì)期提供重要的參考依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料

樣品為市售原味酸乳；培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基和MC培養(yǎng)基。

主要試劑：葡萄糖，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，檸檬酸鈉，磷酸氫二鉀，乙酸鈉，MgSO4·7H2O，MnSO4· 4H2O，吐溫-80，瓊脂粉，氯化鈉，革蘭氏染色液，甲基紅試劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%過氧化氫，吲哚試劑，固體石蠟，氫氧化鈉等。

1.2 方法

1.2.1 酸乳中不同益生菌的分離、鑒定

將酸乳劃線接種于MRS瓊脂平板和MC瓊脂平板中，37℃下厭氧培養(yǎng)。48 h后挑取不同特征的代表性菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察染色反應(yīng)及形態(tài)特征。對兩種培養(yǎng)基中不同特征的菌落接種與乳酸菌微量生化管，24～48 h內(nèi)觀察生化反應(yīng)結(jié)果。根據(jù)形態(tài)、染色結(jié)果及生化反應(yīng)結(jié)果判定益生菌的類型。

1.2.2 活性乳酸菌菌落計數(shù)[6，7]

將酸乳用無菌生理鹽水稀釋成不同梯度，取1 mL傾注平板法接種于MRS瓊脂平板和MC瓊脂平板中，37℃下厭氧培養(yǎng)48 h，實驗取3個連續(xù)濃度，3個平行，以加1 mL無菌生理鹽水為空白對照。根據(jù)1.2.1的結(jié)果，對不同益生菌種類進(jìn)行計數(shù)。

1.2.3 酸乳的pH值及酸度測定[8]

用211型pH計直接測定待測酸乳的pH值，用標(biāo)定后濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，測定出酸乳的酸度值，酸度度數(shù)是以酚酞作指示劑，中和100 mL乳所需氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（濃度為0.1000 mol/L）的毫升數(shù)。

吸取10 mL酸乳，置于250 mL的三角瓶中，加入20 mL水，再加入0.5 mL的0.5%酚酞乙醇溶液，小心搖勻，用的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到微紅色，在1 min內(nèi)不消失為測定終點（終點用0.005%堿性品紅溶液作對照）。

酸度=(VNaOH-V1)×CNaOH×10×10，

式中：VNaOH為消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)；V1為空白溶液耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)；CNaOH為標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的濃度。

1.2.4 貨架期內(nèi)酸乳菌群及pH變化規(guī)律

在室溫和冰箱4℃下低溫放置1，3，5，7，9，11，13，15 d的酸乳，測定其pH值及酸度值，并分別稀釋涂布接種于MRS瓊脂平板和MC瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)48 h，分別計不同乳酸菌數(shù)及總菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 菌落特征及菌體形態(tài)

將酸乳分別劃線接種于MRS瓊脂、MC瓊脂培養(yǎng)基上，48 h后觀察菌落形態(tài)，在MRS瓊脂、MC瓊脂培養(yǎng)基上分別生長出大小不同、顏色稍有差異的菌落，經(jīng)過革蘭氏染色后鏡檢，初步可推斷分別為乳桿菌屬、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌屬。在不同培養(yǎng)基的乳酸菌鏡檢形態(tài)相同的，取其特征明顯、菌落數(shù)較多的選擇性平板，觀察結(jié)果如表1所示。

將表1中的不同菌落分別接種不同的微量生化管，實驗設(shè)3個重復(fù)，其中與②特征相同的菌落接種10組，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，菌落①為嗜熱鏈球菌，菌落②中七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、水楊苷和蔗糖陰性與陽性比例為1︰4，即德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜酸乳桿菌在酸乳中存在的比例為1︰4，菌落③為雙歧桿菌屬。

2.2 貨架期內(nèi)酸乳菌群變化規(guī)律

根據(jù)2.1中菌落形態(tài)與乳酸菌類型的鑒定結(jié)果，對存放于室溫和冰箱4℃下放置的酸乳通過稀釋涂布法培養(yǎng)獲得的不同乳酸菌及總菌落數(shù)進(jìn)行分別計數(shù)，結(jié)果如圖1和圖2所示。

表2 生化實驗結(jié)果

由圖1和圖2可以看出，在貯存的前3 d，常溫存放組除嗜熱鏈球菌外，其他乳酸菌數(shù)菌有所增加，3 d時乳酸菌數(shù)達(dá)到最高，但隨著存放時間的延長，各種乳酸菌均持續(xù)下降。11 d時各種乳酸菌均降低了一個數(shù)量級，到15 d時總菌數(shù)為7.43×108g-1，與存放初期菌數(shù)相比，降低兩個數(shù)量級。4℃存放組3 d內(nèi)菌數(shù)無明顯變化，3 d后乳酸菌數(shù)緩慢下降，15 d后總菌數(shù)為9.6× 109g-1，與存放初期相比，降低一個數(shù)量級，在存放過程中德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜酸乳桿菌下降緩慢，而嗜熱鏈球菌與雙歧桿菌下降較快，15 d后均已降低2個數(shù)量級。其中雙歧桿菌數(shù)量在4℃和常溫下存放15 d，分別由1.1×108g-1降為1.02×107g-1和1.3×108g-1降為0.3×106g-1，4℃與常溫存放存在顯著差異。

2.3 貨架期內(nèi)酸乳pH值與滴定酸度變化

圖3為酸乳在4℃和常溫下存放不同時間的pH值和酸度變化。由圖3可以看出，在貯藏期間隨著貯藏時間的延長酸度呈上升趨勢而pH值呈下降趨勢。實驗結(jié)果表明，市售組和自制組酸乳的變化趨勢基本一致。由于貯藏期間乳酸菌仍然繼續(xù)生長繁殖，發(fā)酵殘余的乳糖產(chǎn)生乳酸，使酸乳的酸度繼續(xù)升高，pH值繼續(xù)下降。

3 討論

3.1 與食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)比較

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中對發(fā)酵乳(GB19302-2010)[9]做出規(guī)定，乳酸菌數(shù)不得低于1×106mL-1?？梢?，酸乳中乳酸菌數(shù)量已正式成為評價酸乳質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。計數(shù)結(jié)果表明市售酸乳在4℃和常溫存放15 d后乳酸菌數(shù)量分別為9.6×109mL-1和7.4×108mL-1，分別高出國家對發(fā)酵乳中乳酸菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求3個數(shù)量級和兩個數(shù)量級，實驗結(jié)果表明，國內(nèi)大型的乳制品企業(yè)對發(fā)酵乳的生產(chǎn)加工技術(shù)已經(jīng)達(dá)到乳酸菌高密度生產(chǎn)水平，為乳酸菌在人體內(nèi)達(dá)到一定的數(shù)量才能調(diào)節(jié)人體腸道菌群的功效提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

3.2 菌群變化與pH值變化

酸乳中乳酸菌群隨儲藏天數(shù)的增加而減少,這是因為乳酸菌群本身的所處介質(zhì)酸度逐漸升高，溫度較低，使菌體生長繁殖受到一定的抑制，但德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜酸乳桿菌對酸的耐受性強于嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌。儲藏初期，德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜熱鏈球菌比例約為1︰1，隨著酸度的增加比例發(fā)生變化,當(dāng)酸度達(dá)到120oT時，4℃存放的其比例接近2︰1，常溫存放組其比例為7.2︰1，而德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌的比例對酸乳制品的風(fēng)味和組織狀態(tài)等有重要的影響，比例越高，風(fēng)味越為不佳。

3.3 貨架期內(nèi)最佳飲用時間的推薦

本實驗研究表明，貯藏期間酸乳的酸度隨著貯藏時間的延長而升高，pH值下降；常溫存放組在3 d內(nèi)乳桿菌有緩慢增加而鏈球菌及雙歧桿菌有較大幅度下降，表現(xiàn)為乳酸菌總數(shù)增加現(xiàn)象，但飲用酸度較大，風(fēng)味不佳，不宜作為酸乳存放方法，建議常溫下存放最好在當(dāng)天飲用。4℃存放組乳酸菌數(shù)在5 d內(nèi)變化不大，以后逐漸下降。有報道稱，酸乳在4℃貯藏3 d內(nèi)的酸乳具有較好的免疫促進(jìn)作用，保健功能較好，貯藏期再延長，則效果不佳。酸乳在發(fā)酵過程中，通過釋放活性肽，乳酸菌發(fā)揮重要的機體免疫免疫調(diào)節(jié)作用。因此建議最佳飲用時間為3～5 d。

[1]謝繼志,肖紅彬.酸乳中乳酸菌數(shù)及酸度的檢測與評價[J].中國乳品工業(yè),2002,1:22-23

[2]Giacomo Pagliaro,Maurizio Battino.The Use of Probiotics in Gastrointestinal Diseases[J].Mediterr J Nutr Metab.,2010,3:105-113.

[3]王東，王與寶，伊大忠，趙盛英.凝固型雙歧桿菌酸奶在儲存過程的變化研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù),2008（3）:126-127.

[4]趙強忠,趙謀明,蔣文真.一種分離和檢測酸乳中乳酸菌的有效方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(13):96-99.

[5]辛若竹,丁梅,孟憲志,等,活性酸乳中每種益生菌總數(shù)的同時計數(shù)法[J].食品科學(xué),2008,29（4）:244-248.

[6]GB/T 4789.34－2008,食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗-雙歧桿菌檢驗[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[7]GB/T 4789.35－2008,食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗-食品中乳酸菌檢驗[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[8]GB/T 5009.46-2003,乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[9]GB 19302-2010,食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-發(fā)酵乳[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

During the yoghurt's shelf-life to research the content of probiotics and Aciditie's change

ZHU Li-yun ZHANG Yong-jun GAO Yong-sheng MIN Yue-shuang YANG Lian-yang
（College of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China）

In this study,the probiotics and yogurt’s pH and acidity have been measured and analyzed,so as to provide an important reference for determining the shelf life of products.Have been anaerobic cultured on the MRS and MC culture medium,the total Probiotics species were analyzed by the colony characteristics,mycelial morphology and some physicochemical properties of allLactobacillusspecies of active Probiotics,includingLactobacillus bulgaricus,Streptococcus thermophilus,Lactobacillus acidophilusandBifidobacteria.during yogurt be stored in 10 d,The count of probiotics andBifidobacteriadecreased in 4℃slowlier decuple than that of usual temperature,Probiotics number affected greatly by yogurt’s acidity.

Probiotics;Yogurt;counting

TS252.54

A

1001-2230（2011）06-0034-03

2011-03-16

朱麗云（1976-），女，講師，從事微生物發(fā)酵、食品深加工及開發(fā)研究。