羧甲基殼聚糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響研究*

劉萬順,鄭美玲,韓寶芹,亢壽海,李 南

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.江蘇省腫瘤研究所,江蘇南京210008)

羧甲基殼聚糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響研究*

劉萬順1,鄭美玲1,韓寶芹1,亢壽海2,李 南1

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.江蘇省腫瘤研究所,江蘇南京210008)

研究評(píng)價(jià)了不同分子量及不同取代度的3種羧甲基殼聚糖(CM-CTS)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。用MTT比色法測(cè)定3種CM-CTS對(duì)人正常肝細(xì)胞L02及3株腫瘤細(xì)胞:Bel-7402、SGC-7901及Hela生長(zhǎng)的影響;EL ISA方法檢測(cè)3種CMCTS對(duì)2種肝細(xì)胞L02及Bel-7402分泌TGF-α及VEGF水平的影響;建立小鼠移植性腫瘤Heps模型,腹腔注射分子量最大的CM-Ⅰ,研究CM-CTS的抑瘤作用。研究結(jié)果表明,分子量及取代度不同的3種CM-CTS在0.05～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi),對(duì)L02細(xì)胞增殖具有顯著促進(jìn)作用,對(duì)Bel-7402、SGC-7901及Hela細(xì)胞的增殖則具有一定的抑制作用;3種CM-CTS能提高L02細(xì)胞TGF-α分泌水平,抑制Bel-7402細(xì)胞分泌TGF-α及VEGF水平;在動(dòng)物水平上,CM-CTS能抑制小鼠Heps腫瘤生長(zhǎng),且量效關(guān)系顯著。說明不同分子量及取代度的3種羧甲基殼聚糖對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具一定的抑制作用。

羧甲基殼聚糖;腫瘤;細(xì)胞因子

羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan,CMCTS)是殼聚糖改性研究和應(yīng)用研究最多的1種殼聚糖衍生物,具有良好的水溶性、優(yōu)良的成膜性和保濕性等,在日化、食品、醫(yī)藥及醫(yī)用生物材料等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。CM-CTS作為生物醫(yī)用材料在燒傷敷料、防術(shù)后黏連材料、藥物載體及酶抑制劑等領(lǐng)域中研究較多[2]。CM-CTS含有-NH2和-COOH,其分子量和羧基取代度不同,使生物學(xué)活性存在較大差異。細(xì)胞水平的研究證明,CM-CTS具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[3],而其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響則報(bào)道較少,故開展CM-CTS對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響具有重要的理論意義和實(shí)際意義。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同分子量及不同羧化度的CM-CTS對(duì)人正常肝細(xì)胞L 02及3株腫瘤細(xì)胞:Bel-7402、SGC-7901及Hela體外增殖及相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌水平的影響,以及對(duì)Heps小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響,為CM-CTS在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3種CM-CTS樣品均由本實(shí)驗(yàn)室制備,分別標(biāo)記為CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ。人正常肝細(xì)胞L 02及人肝癌細(xì)胞Bel-7402購自中國(guó)海洋大學(xué)藥物研究所;人胃癌細(xì)胞SGC-7901及人宮頸癌細(xì)胞Hela由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。4種細(xì)胞均于含10%新生牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代;昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(20±1)g,由南京安立默實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心提供。Heps荷瘤小鼠購自北京鼎國(guó)生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

RPM I1640培養(yǎng)基(Gibco),新生牛血清(Hyclone),胰蛋白酶和M TT(Sigma),人TGF-α和VEGF EL ISA試劑盒(上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

真空冷凍干燥機(jī)(Labconco),高效液相色譜儀(美國(guó)Waters),倒置顯微鏡(日本Olympus),超凈工作臺(tái)、BB16FCO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司),Rayto2100C酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料純化及性質(zhì)研究 CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ樣品于三蒸水中溶解透析,經(jīng)0.22μm濾膜過濾,真空冷凍干燥。GPC-HPLC測(cè)定樣品分子量,流動(dòng)相:0.02M PBS溶液;流速:0.8 mL/min;柱溫:35℃;示差檢測(cè)器;右旋糖苷標(biāo)樣。采用電位滴定法測(cè)定羧基取代度[4]。

1.3.2 體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02、Bel-7402、SGC-7901及Hela細(xì)胞,胰酶消化后,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL,接種于96孔板,每孔200μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)不同濃度CM-CTS實(shí)驗(yàn)組,細(xì)胞對(duì)照組及空白對(duì)照組。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好時(shí),吸去原培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組分別加入含不同濃度CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ的RPM I1640培養(yǎng)基,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)孔,細(xì)胞對(duì)照組加入等量RPM I1640培養(yǎng)基。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)2 d及4 d,M TT法測(cè)定其在492 nm處測(cè)吸光值,計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR):

上式中,D0,D1及D2分別為空白組,實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的吸光值。

1.3.3 3種CM-CTS對(duì)L 02及Bel-7402細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子水平的影響 細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.3.2,實(shí)驗(yàn)設(shè)不同濃度CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ實(shí)驗(yàn)組、細(xì)胞對(duì)照組及空白對(duì)照組。不同組別的細(xì)胞采用無血清培養(yǎng)基。24 h后收集培養(yǎng)液,離心、收集上清液,按照EL ISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作,分別測(cè)量L02及Bel-7402細(xì)胞分泌TGF-α水平及Bel-7402細(xì)胞分泌VEGF水平。

1.3.4 體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn) 取腫瘤生長(zhǎng)旺盛的荷瘤小鼠,頸椎脫臼處死,無菌條件下取出瘤塊,制備成單細(xì)胞懸液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/m L,接種于健康小鼠右前肢腋窩皮下,每只0.2 m L[5]。接種24 h后隨機(jī)分為低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只。由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)和實(shí)驗(yàn)時(shí)間的限制,作者選擇分子量最大的CM-Ⅰ作為受試物。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別以75、150和300 mg·kg-1劑量腹腔注射CM-Ⅰ給藥,隔日1次,連續(xù)2周。停藥24 h后頸椎脫臼處死小鼠,稱體質(zhì)量,解剖剝離瘤塊,稱瘤質(zhì)量。對(duì)照組平均瘤質(zhì)量1 g以上可進(jìn)行結(jié)果分析,計(jì)算抑瘤率:抑瘤率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用方差分析(one way ANOVA),P<0.05有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 3種CM-CTS理化性質(zhì)

3種CM-CTS樣品均有良好的水溶性,分子量及羧化度測(cè)定結(jié)果如表1所示,其中CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ的分子量依次減小;CM-Ⅰ及CM-Ⅲ的羧基取代度相近,CM-Ⅱ羧基取代度較低。

表1 3種CM-CTS的主要物理性質(zhì)Table 1 The Physical p roperties of three CM-CTS samp les

2.2 CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對(duì)4種細(xì)胞增殖的影響

由表2可知,在0.05～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)作用2 d時(shí),CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對(duì)人正常肝細(xì)胞L02的增殖均有顯著的促進(jìn)作用,RGR平均值基本一致,分別為110.8%、114.4%和113.4%。但3種受試物促生長(zhǎng)作用的最優(yōu)濃度不同,分別為0.3、0.8和0.1 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對(duì)人肝癌細(xì)胞Bel-7402的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定程度的抑制作用(P<0.05),三者的抑制作用濃度范圍分別為0.1～0.8 mg/mL(2 d)、0.05～0.8 mg/mL(2 d)及0.1～5.0 mg/mL(2 d),作用4 d時(shí),生長(zhǎng)抑制作用減弱;CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定程度的抑制作用(P<0.05),在5.0 mg/mL時(shí)抑制效果最為明顯,RGR可分別達(dá)55.6%(2 d)、79.1%(2d)及72.4%(2 d);對(duì)于Hela細(xì)胞,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ在低濃度范圍內(nèi)對(duì)其生長(zhǎng)作用不明顯,在5.0 m g/m L時(shí)有一定程度的抑制作用,RGR分別為67.9%(2 d)、83.2%(2 d)及82.2%(2 d)。

2.3 CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ對(duì)細(xì)胞因子TGF-α及VEGF分泌的影響

TGF-α是1種參與調(diào)節(jié)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖、分化的細(xì)胞因子,是正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞增殖分化過程中必不可少的有絲分裂原。由圖1所示,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ均顯著促進(jìn)人正常肝細(xì)胞L 02分泌TGF-α水平,其作用的濃度范圍分別為0.1～5.0、0.1～0.8和0.1～5.0 mg/m L;同時(shí),CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ均顯著抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402分泌TGF-α水平,抑制作用的濃度范圍分別為0.1～5.0、0.1～0.3及0.1～5.0 mg/mL。

VEGF是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的最主要的細(xì)胞因子。由由圖1可見,CM-Ⅰ、CM-Ⅱ及CM-Ⅲ能顯著抑制人肝癌細(xì)胞Bel-7402分泌VEGF水平,三者抑制作用的濃度范圍分別為0.1、0.1～5.0和0.1～5.0 mg/mL。

表2 3種CM-CTS對(duì)4種細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effects of three CM-CTSon the proliferation of four cells(n=5,?x)

圖1 3種CM-CTS對(duì)TGF-α及VEGF分泌的影響Fig.1 Effect of three CM-CTSon the secretion of TGF-αand VEGF(n=3,x?±SD,*P<0.05 vs control)

2.4 CM-Ⅰ對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

由表3和圖2可見,不同劑量的CM-Ⅰ均能抑制小鼠實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。CM-Ⅰ在75,150及300 mg·kg-1時(shí)抑瘤率分別為12.9%,18.2%及22.1%(見表3)。與對(duì)照組相比,CM-Ⅰ對(duì)小鼠體重?zé)o顯著性影響。在實(shí)驗(yàn)過程中,實(shí)驗(yàn)組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)較好,主要表現(xiàn)為活動(dòng)、飲食量增加,皮毛光亮,表明CM-CTS對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體毒性較小。

表3 CM-Ⅰ對(duì)Heps實(shí)體瘤模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of CM-Ⅰon the grow th of Heps tumo r in mice(n=10,?x±SD)

圖2 CM-Ⅰ對(duì)小鼠Heps腫瘤形態(tài)的影響Fig.2 Effect of CM-Ⅰon the morphology of Heps tumo r

3 討論

本文主要研究CM-CTS對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。體外實(shí)驗(yàn)表明,CM-CTS對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)出了相反的影響結(jié)果,3種不同分子量不同羧化度的CM-CTS在一定濃度范圍內(nèi),對(duì)人正常肝細(xì)胞L 02的增殖均具有顯著的促進(jìn)作用,但對(duì)3株腫瘤細(xì)胞:Bel-7402、SGC-7901及Hela的增殖則表現(xiàn)出輕微抑制作用。在本文的研究中,CM-CTS的分子量和羧化度在對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響中,沒有較大的不同。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示,腹腔注射CM-Ⅰ機(jī)體毒性較小并對(duì)小鼠Heps實(shí)體瘤生長(zhǎng)具劑量相關(guān)抑制作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了CM-CTS的抗腫瘤生長(zhǎng)作用。

CM-CTS對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用已經(jīng)在正常皮膚成纖維細(xì)胞[6]及角質(zhì)形成細(xì)胞[3]的生長(zhǎng)中得到驗(yàn)證;殼聚糖對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用分別在宮頸癌Hela細(xì)胞[7]及艾氏腹水瘤(EA T)細(xì)胞[8]生長(zhǎng)研究中得到驗(yàn);CM-CTS對(duì)人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞95-D的生長(zhǎng)具抑制作用[9]。CM-CTS對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的不同方向的調(diào)節(jié)作用,可能與正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同有關(guān),其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前,CM-CTS體內(nèi)抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚未清楚。楊靖亞等[10]發(fā)現(xiàn)灌胃給藥CM-CTS能促進(jìn)機(jī)體分泌IFN-γ、IL-2,增強(qiáng)N K細(xì)胞活性等增強(qiáng)機(jī)體免疫力,從而對(duì)S180實(shí)體瘤生長(zhǎng)具抑制作用。劉艷如等[11]研究發(fā)現(xiàn)CM-CTS能提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù),對(duì)小鼠外周血清溶血素抗體的生成和血凝素抗體積數(shù)生成有顯著影響。因此,腹腔注射CM-CTS對(duì)Heps實(shí)體瘤生長(zhǎng)的抑制作用的機(jī)制可能與其對(duì)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。

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Study on the Antitumo r Effect of Carboxymethyl Chitosan

L IU Wan-Shun1,ZHENG M ei-Ling1,HAN Bao-Qin1,KANG Shou-Hai2,L INan1
(1.College of Marine Life Science,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Institute of Oncology of Jiangsu,Nanjing 210008,China)

The effects of three carboxymethyl chitosan(CM-CTS)with different molecular weights(MW)and different substituted degrees(DS)on the grow th of tumo r w ere studied.Effects of CM-CTS on the grow th of human no rmal liver cell L 02 and three tumo r cell lines:Bel-7402,SGC-7901 and Hela were measured by M TT assay,w hile levels of transforming grow th factor-α(TGF-α)and vascular endothelial grow th factor(VEGF)secreted by L 02 and Bel-7402 cells were measured by EL ISA.In vivo,tumo r modelsof Hep smice w ere established and CM-CTSwith the highestmolecular weight w as administered through intraperitoneal injection to investigate tumor inhibitory effect.CM-CTSwith different MW and different DS all p romoted the proliferation of L02 cells but slightly inhibited that of Bel-7402,SGC-7901 and Hela cellswithin the concentration of 0.05—0.8 mg/mL.They also could imp rove the TGF-α secretion of L02 cells,w hereas decreased TGF-αand VEGF secretion of Bel-7402 cells.CM-CTSalso inhibited the grow th of Heps tumor in a dose-dependentmanner.CM-CTSexhibited inhibitory effect on the grow th of tumo r bo th at cellular level and tissular level.

carboxymethyl chitosan;cancer;cytokine

[Q539+.7];R735.7

A

1672-5174(2011)09-036-05

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA091603)資助

2011-01-17;

2011-04-18

劉萬順(1950-),男,博導(dǎo),從事生物化學(xué)與海洋生物材料研究。E-mail:WanshunLiu@hotmail.com

責(zé)任編輯 朱寶象