一株低溫降解菌的分離鑒定及其降解特性研究*

閆法軍,田相利,董雙林,牛宇峰

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

一株低溫降解菌的分離鑒定及其降解特性研究*

閆法軍,田相利**,董雙林,牛宇峰

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

從刺參(A postichopus japonicus)養(yǎng)殖池塘環(huán)境中馴化分離篩選到1株低溫有機(jī)物和氨氮降解菌株DB11。根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,將該菌株鑒定為馬氏副球菌(Paracoccus marcusii)。經(jīng)馴化,該菌株以刺參餌料為唯一營養(yǎng)源,低溫(15℃)、低接種量(<5×10-3)條件下能同時高效降解餌料中的有機(jī)物和氨態(tài)氮,5 d時間內(nèi)對富集培養(yǎng)基中COD和NH4+-N的降解率分別達(dá)50%和98%。進(jìn)一步研究其降解特性表明,菌株生長適溫15～30℃,生長適宜p H值為7～10,降解刺參餌料中COD和N-N的最適溫度條件為15～20℃、最適p H條件為8.0～8.5;在最適降解條件下、接種量為5×10-3時,對10～20 g/L高質(zhì)量濃度的刺參餌料液中COD降解效果顯著,3 d時間去除率達(dá)56.9%～65.7%,對1～20 g/L質(zhì)量濃度的刺參餌料液中N-N 3 d時間的去除率達(dá)91.7%～99.9%。

低溫菌;有機(jī)物;氨氮;分離鑒定;降解特性

刺參養(yǎng)殖業(yè)是我國新近迅速形成的1個經(jīng)濟(jì)效益很高的產(chǎn)業(yè),主要分布在遼寧和山東沿海,是我國海水養(yǎng)殖的重要特色支柱產(chǎn)業(yè)之一。近幾年來,類似對蝦、扇貝和魚類養(yǎng)殖,刺參養(yǎng)殖也相繼發(fā)生病害,大批量死亡造成該產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失,成為制約該產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸[1]。目前大部分刺參養(yǎng)殖主要依靠投喂人工飼料,飼料的粘著性極差,溶解散失嚴(yán)重,加上池底設(shè)置了大量的人工附著基,大量未利用的飼料殘留在養(yǎng)殖池塘,這些殘餌顆粒物將會有90%以上沉積富集在池塘底部[2],而富集在底泥中的這些污染物,在一定條件下會重新以有機(jī)物和可溶性無機(jī)氮如NH+4-N、N-N等的形式釋放到養(yǎng)殖水體中,惡化了水質(zhì);同時,由于池塘底部溫度相對穩(wěn)定,有機(jī)物和營養(yǎng)元素豐富,為有害微生物的繁殖提供了“溫床”,這些有害微生物的大量繁殖使養(yǎng)殖對象處于1個不健康的環(huán)境中,極易發(fā)生暴發(fā)性疾病[3]。因此,研究刺參養(yǎng)殖環(huán)境中餌料污染的快速解決方法,對改善修復(fù)養(yǎng)殖水體,減少養(yǎng)殖病害的發(fā)生,促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前微生物在環(huán)境污染控制和修復(fù)方面的作用受到人們的廣泛關(guān)注,國內(nèi)外對此研究頗多[4-6],在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面也不勝枚舉[7-9]。隨著養(yǎng)殖污染的日趨嚴(yán)重,從養(yǎng)殖環(huán)境及養(yǎng)殖動物體上分離土著菌作為高效降解微生物的開發(fā)研究來源繼而應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn),已成為人們的研究熱點(diǎn),并取得了很大的成就[10-13]。但這些研究大多集中于魚蝦貝,對于刺參卻鮮有報(bào)道。

本文旨在通過對刺參養(yǎng)殖池塘中高效低溫餌料降解菌的分離篩選,獲得能適于刺參養(yǎng)殖環(huán)境快速生長并能快速降解刺參殘餌中的有機(jī)物和氨氮的優(yōu)良菌株,從而為刺參養(yǎng)殖環(huán)境的改善修復(fù)及刺參池塘微生態(tài)制劑的研制工作提供基礎(chǔ)條件。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

刺參餌料:含粗蛋白25.9%,粗脂肪0.81%,碳水化合物47.0%,能值14.9216 kJ/g。

富集培養(yǎng)基:刺參餌料20 g(研成細(xì)粉),無菌陳海水1 000 mL,餌料水溶液煮沸后置于超凈臺浸泡48 h,離心取上清,p H=8.0,121℃,滅菌20 min備用。

馴化培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,按10%的比例逐級增加餌料質(zhì)量,提高餌料滲出液濃度,pH=8.0,121℃,滅菌20 min備用。

分離培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基1 000 mL,瓊脂20 g,p H=8.0,121℃,滅菌20 min后倒平板備用。

1.2 樣品采集與處理

2008年5月從山東省青島市膠南原瑯琊第二蝦場的3個刺參養(yǎng)殖池塘中用無菌器皿分別采集水樣、泥樣(池塘底泥和刺參附著基泥)和刺參腸道樣。取泥樣1 g置于盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中,充分打勻后取上清液。同時,取刺參腸道樣1 g置于盛有9 mL無菌生理鹽水的研磨器中,充分研磨后取上清液,然后制備樣品液。水樣不做處理,直接作為樣品液備用。

1.3 菌株的富集、馴化與分離

將不同來源的樣品液分別接種于100 mL富集培養(yǎng)基中,15℃搖床振蕩培養(yǎng)1周后按10%的接種量轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)7d,同樣的操作方法連續(xù)富集馴化6次。取最后一次的培養(yǎng)液采用平板涂布法在分離培養(yǎng)基上涂布分離,挑取生長較好的單菌落經(jīng)多次劃線純化,獲得單菌株,編號保種。

1.4 菌株篩選

1.4.1 初篩 初將活化的細(xì)菌采用平板劃線法在分離培養(yǎng)基上劃線后,15℃培養(yǎng)48～72 h,記錄細(xì)菌的生長情況,選取能在48～72 h內(nèi)生長良好的細(xì)菌,作為二篩的菌株。

1.4.2 二篩 對初篩得到的菌株進(jìn)行好氧性檢測。將活化的菌懸液以10%的接種量接于盛有富集培養(yǎng)基的試管中,搖勻后15℃靜置培養(yǎng)48～72 h,選取在富集培養(yǎng)液上層液面生長、生長好的菌株進(jìn)行下一步的篩選。

1.4.3 三篩 菌株的潛在致病性檢測。根據(jù)俞勇等[14]的報(bào)道,利用血平板(購于濟(jì)南百博生物技術(shù)有限責(zé)任公司)檢測菌株有無潛在的致病性,可以淘汰一部分潛在的病原菌。用無菌牙簽分別挑取二篩菌株單菌落點(diǎn)種于血平板,置于15℃恒溫培養(yǎng)48～72 h后觀測有無溶血圈,選取無溶血圈的菌株進(jìn)行下一步的研究。

1.4.4 四篩 通過檢測細(xì)菌對刺參餌料的降解能力進(jìn)行四篩,檢測項(xiàng)目有COD和NH4-N,即通過培養(yǎng)一定時間后測定各菌株對餌料富集培養(yǎng)液中的COD值和氨氮值的去除率大小來衡量細(xì)菌利用刺參餌料的能力。每株菌為1個處理,初始菌濃度皆為1.0×106cfu/mL(即時以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[15]),以不加菌的處理作為對照,每個處理設(shè)3個平行,15℃、160 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)5 d后,取樣于6 000 r/min離心10 min后取上清,立即測定上清液COD和NH4-N值,用1-COD5/COD0、1-N H4-N5/N H4-N0分別表示各菌株對刺參餌料中有機(jī)污染物和氨氮的5 d的降解效果,選取降解效果最好的菌株進(jìn)行研究。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 菌株的形態(tài)觀察及生理生化鑒定 按照文獻(xiàn)[15-16],對菌株的形態(tài)學(xué)特征及生理生化特性進(jìn)行了初步鑒定。

1.5.2 菌株的16S rDNA序列測定 基因組DNA采用水煮法提取[17]。16S rDNA擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物,正向引物:5′-AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG-3′(E.coli27F),反向引物:5′-TAC GGC TAC CTTGTTACG ACTT-3′(E.coli 1492R)。PCR產(chǎn)物(1.5 kb左右)送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果用Blast軟件與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的相關(guān)屬種的16S rRNA序列進(jìn)行比對,參照文獻(xiàn)[18]采用Clustal X、BioEdit和MEGA 4.1等軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,Kimura2-Parameter Distance模型計(jì)算進(jìn)化距離,用Neighbor-Joning法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,1000次Replications,計(jì)算Bootstrap值評估樹的置信度。

1.6 菌株降解特性研究

生長曲線測定:采用光電比濁法[19],將菌株活化培養(yǎng)24 h后按1%的接種量接種2216E液體培養(yǎng)基,在15℃、160 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng),每2 h取3個重復(fù)樣測定OD600值,以平均值繪制生長曲線。

降解特性研究:接種菌體于2216E培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(約培養(yǎng)32 h),離心收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌2次后重懸作為降解試驗(yàn)接種菌液。若無特別說明,試驗(yàn)均以富集培養(yǎng)基為菌培養(yǎng)液,體積為100 mL,菌體接種量為(1～5)×10-3(菌培養(yǎng)液菌體密度為1.0×106cfu/mL),15℃,160 r/min搖床振蕩培養(yǎng),定時取樣,每個處理3次重復(fù),菌體生長量采用光電比濁法測定OD600值表示。研究菌體生長和對COD、氨氮降解的關(guān)系。研究溫度對菌體生長和餌料液中COD、氨氮降解的影響,溫度分別設(shè)置為5、10、15、20、25和30℃。研究初始p H值對菌體生長和對COD、氨氮降解的影響,初始p H值分別設(shè)置為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0。研究餌料質(zhì)量濃度對菌體生長和對COD、氨氮降解的影響,不同餌料質(zhì)量濃度設(shè)置方法:陳海水分別浸泡不同質(zhì)量的刺參餌料(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和20.0 g/L),48 h后離心取上清。

1.7 分析方法

參照文獻(xiàn)[20],COD采用堿性高錳酸鉀法進(jìn)行測定,NH4-N采用靛酚蘭比色法進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)所用試劑藥品均為分析純。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0 for Windows軟件進(jìn)行,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±S.D.)表示。各處理之間的差異采用單因子方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan多重比較法進(jìn)行,當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離與篩選

經(jīng)多次富集和馴化,從3個刺參養(yǎng)殖池塘的不同來源樣品中共分離純化出18株細(xì)菌以供篩選。初篩、二篩和三篩后,共篩選到8株低溫菌。對此8株菌進(jìn)行四篩,結(jié)果如表1所示。

表1 菌株利用刺參餌料能力Table 1 Biodegradation of sea cucumber feed by bacteria strains

實(shí)驗(yàn)所用刺參餌料液有機(jī)物濃度高達(dá)878.4±32 mg/L,氨氮濃度為22.79±0.51 mg/L。在以刺參餌料為營養(yǎng)物質(zhì)的情況下,各菌株對餌料中有機(jī)物和氨氮的利用能力不同。在5 d的時間里,發(fā)現(xiàn)DB11、13、19和20這4株菌能高效利用刺參餌料中的有機(jī)物,與對照差異顯著(P<0.05),其中DB11利用有機(jī)物能力最強(qiáng),去除率達(dá)50%;在氨氮降解方面,只有菌株DB11對餌料中的氨氮有很強(qiáng)的去除作用,5 d內(nèi)達(dá)到了98%的去除率,而其它菌株與對照相比,不但沒有降解氨氮作用,反而使餌料中氨氮濃度有顯著的不同程度的提高(P<0.05),分析原因可能是菌株分解有機(jī)物的同時產(chǎn)生了大量的氨氮而本身又不降解所致。綜合以上,本文選取最優(yōu)菌株DB11進(jìn)行相關(guān)研究。

2.2 菌株鑒定

經(jīng)分離篩選,得到1株能高效降解刺參餌料中有機(jī)物和氨氮的菌株DB11。經(jīng)初步鑒定,菌株DB11為球狀,革蘭氏陰性,不運(yùn)動,沒有鞭毛,不產(chǎn)生芽孢;在2216E固體平板上15℃培養(yǎng)48～72 h,其菌落呈橘黃色、圓形、隆起、不透明、邊緣整齊、表面較濕潤光滑;單個、兩兩或短鏈相聚,二分裂方式生殖。菌株生理生化特性見表2。

表2 菌株DB11的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DB11

菌株DB11的16S rDNA序列已在GenBank中注冊,登錄號:GU338411。將其與數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對分析,發(fā)現(xiàn)與該菌株序列同源性最高的絕大多數(shù)為副球菌屬(Paracoccussp.)的菌株,選取相關(guān)菌株的16S rDNA序列用Neighbour-Joining method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)。由圖1所示,菌株DB11位于Paracoccus分支上,與副球菌屬的Paracoccus marcusii(EF491972)序列相似性達(dá)99.7%,結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性,將菌株DB11初步鑒定為馬氏副球菌。

圖1 菌株DB11及其相關(guān)菌的基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of strain DB11 and other related strains using Neighbour-Joining method

2.3 菌株特性研究

2.3.1 生長曲線的測定 采用光電比濁法測定了菌株DB11的生長曲線。結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株DB11的生長曲線Fig.2 Growth curve of strain DB11

由圖可見,0～6 h菌處于生長延滯期,6～42 h處于生長的對數(shù)期,生長速度明顯加快,尤其在30～32 h之間菌生長最快,42 h后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。

該菌株屬于低溫菌,生長周期比較長,其在2216E中的生長特征與其在刺參餌料富集培養(yǎng)基中有明顯不同(見下文圖3:菌株在富集培養(yǎng)基中的生長特征)。通過比較發(fā)現(xiàn),該菌在刺參餌料富集培養(yǎng)基中生長對數(shù)期長,第1～2天生長迅速,約在第4天達(dá)到穩(wěn)定期;生長量大,在對數(shù)期的第2 d生長量OD600值就達(dá)到1.91±0.14,穩(wěn)定期的生長量OD600值約為2.55±0.09,均明顯高于其在2216E培養(yǎng)基中的最大生長量1.66±0.05,因此從菌生長量和生長周期兩方面考慮該菌更適于在刺參餌料富集培養(yǎng)基中生長。

2.3.2 菌體生長與COD、NH4-N降解的關(guān)系 菌體生長與COD降解之間的關(guān)系如圖3所示?？梢钥闯?菌體的生長對餌料液中的COD具有明顯的去除作用,一定時間內(nèi)(2～5 d)COD濃度隨著細(xì)菌的生長不斷降低,總?cè)コ蔬_(dá)54.3%。在第1天菌體雖然有所生長,但對COD的降解作用不顯著,可能是因?yàn)榫陝倧难訙谶M(jìn)入對數(shù)期、對餌料液的作用時間不夠;在第2天COD濃度開始顯著降低,與細(xì)胞已進(jìn)入對數(shù)生長期(OD值顯著提高)具有很大的關(guān)系;整個試驗(yàn)期間以第2天～第3天的去除效果最好,2 d內(nèi)去除率達(dá)46.6%,占總?cè)コ实慕^大部分,這與菌株在第2～3天時生長最快、處于對數(shù)期不無相關(guān);到第5天COD達(dá)到最大去除率,餌料液中COD濃度達(dá)到最低值,之后的5～7 d時間COD全都維持在最低水平,這也與菌體在第4～7天生長不顯著、達(dá)到穩(wěn)定期或衰亡期有關(guān)。綜上所述可以看出,7 d試驗(yàn)期間在2～5 d菌體的生長對餌料液中COD含量有明顯的去除作用,菌體生長的快慢對COD降解的大小有直接的顯著的影響。

菌體生長與NH4-N降解之間的關(guān)系如圖4所示?？梢钥闯?菌體的生長對餌料液中的NH4-N含量亦有明顯的去除和控制作用,一定時間內(nèi)去除率幾乎達(dá)100%。具體從第1天開始,餌料中的NH4-N含量就急劇下降,至第3天達(dá)到最低值0.04 mg/L,去除率達(dá)99.85%;第4天氨氮濃度仍處于很低的水平,第5天開始慢慢上升,至6～7 d的2 d內(nèi)基本維持在5 mg/L以下,遠(yuǎn)小于初始氨氮濃度。菌體的生長以2～3 d生長最快,處于對數(shù)期,對氨氮的降解作用顯著;第4天之后生長緩慢,開始進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期,從而導(dǎo)致氨氮濃度有些許的升高?？偟目磥?菌株對餌料中的氨氮有很好的降解作用,菌體的快速生長能有效去除餌料中的氨氮。

圖3 菌株DB11的生長與COD降解關(guān)系Fig.3 Influence of the growth of strain DB11 against degradation of COD

圖4 菌株DB11的生長與氨氮降解關(guān)系Fig.4 Influence of growth of strain DB11 against degradation of NH4-N

2.3.3 溫度和初始p H對菌體生長和對COD、氨氮降解的影響 從圖4中可見,菌株DB11在5～30℃溫度下均能生長,適溫溫度范圍為15～30℃,在適溫溫度范圍內(nèi)菌株的生長量無顯著性差異,但其對COD和氨氮的降解程度卻不同。菌株對COD的降解在15～30℃適溫范圍內(nèi)效果都很好,但最佳降解溫度為20℃(P<0.05),15、25和30℃彼此之間無顯著性差異;對氨氮的降解以10～25℃較好,最佳降解溫度為15℃(P<0.05)。菌株DB11降解餌料COD和氨氮的最佳溫度雖不一致,但差別不大,考慮菌株的生長量和刺參自身的生長溫度環(huán)境,本文選擇15～20℃作為菌株DB11降解刺參餌料的最佳溫度范圍。

圖5表明,菌株DB11生長的適宜p H范圍為7～10,最適p H為8,屬于典型的海水菌;在降解COD方面,發(fā)現(xiàn)整個p H范圍內(nèi)COD降解率變化基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢,同菌株的生長量變化趨勢基本一致,菌株的最佳降解p H范圍為7.5～8.5,在此范圍之外降解率都有不同程度的明顯的降低;菌株對氨氮的降解以p H范圍為8～10最好,當(dāng)p H<8時氨氮降解率逐漸降低,可見高p H值有利于菌株對氨氮的降解。通過分析發(fā)現(xiàn),菌株DB11不宜于在酸性環(huán)境下生長,其對餌料中COD和氨氮的去除效果也容易受酸性條件的制約,結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析及養(yǎng)殖實(shí)際情況,本文確定p H值為8.0～8.5是菌株生長和餌料降解最佳p H范圍。

圖5 溫度對菌株DB11菌體生長和COD、氨氮降解的影響Fig.5 Effects of temperature on growth of strain DB11 and degradation of COD and NH4-N

圖6 p H對菌株DB11菌體生長和COD、氨氮降解的影響Fig.6 Effects of p H on growth of strain DB11 and degradation of COD and NH4-N

2.3.4 刺參餌料質(zhì)量濃度對菌體生長和對COD、NH4-N降解的影響 從圖7所示可見,COD和N H4-N隨餌料變化變化趨勢呈現(xiàn)出一致性,當(dāng)餌料質(zhì)量濃度<5.0 g/L時,COD和N H4-N含量在數(shù)值上隨著餌料質(zhì)量濃度的增加而略有增加,但均無顯著性差異(P>0.05),COD含量在27.0～72.2 mg/L之間,N H4-N含量在0.36～0.55 mg/L之間,當(dāng)餌料質(zhì)量濃度>5.0 g/L時,COD和NH4-N含量均隨著餌料質(zhì)量濃度的增加而明顯的增加(P<0.05),尤其在5.0～15.0 mg/L之間增加顯著,在20.0 g/L的刺參餌料浸泡液COD高達(dá)1228.8±83.20 mg/L,NH4-N高達(dá)18.57±0.25 mg/L。可見,餌料質(zhì)量濃度直接決定著餌料液中COD和N H4-N的含量。

圖7 不同質(zhì)量刺參餌料中COD、氨氮含量的變化Fig.7 Fluctuation of COD and NH4-N contained in sea cucumber feed

圖8 刺參餌料質(zhì)量濃度對菌株DB11菌體生長和COD、氨氮降解的影響Fig.8 Effects of concentration of sea cucumber feed on growth of strain DB11 and degradation of COD and NH4-N

由圖8可知,不同刺參餌料質(zhì)量濃度對菌株DB11的生長及其對餌料的降解作用有顯著的影響。在菌體生長方面,不同餌料質(zhì)量濃度下的菌體生長量呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05),餌料質(zhì)量濃度越高,菌體生長量越大,尤其在2.0～5.0 g/L和5.0～10.0 g/L之間的菌體生長量增長幅度最大,可見,餌料質(zhì)量濃度的高低在一定范圍內(nèi)決定著菌體生長量的大小,濃度越高,菌體生長量越大,反之,越低。在餌料降解方面,餌料質(zhì)量濃度在1.0 g/L以上時,菌株有不同程度的顯著的餌料降解作用,如在1.0～5.0 g/L的時候,菌株DB11對有機(jī)物有一定的降解作用,當(dāng)餌料質(zhì)量濃度大于10.0 g/L的時候,各處理之間無顯著性差異,COD去除率均能達(dá)到50%以上,其中以15.0 g/L的去除率最高,3 d內(nèi)降解率為65.7%±7.32%,菌株DB11對N-N的降解作用相當(dāng)好,對整個餌料濃度范圍(1.0～20.0 g/L)內(nèi)的氨氮3 d時間內(nèi)幾乎達(dá)到了100%的去除率;餌料質(zhì)量濃度低于1.0 g/L時,菌株不但沒有餌料降解作用,反而增加餌料液中的COD和N-N含量(P<0.05),分析原因可能是餌料質(zhì)量濃度太低,其中的營養(yǎng)物質(zhì)匱乏,導(dǎo)致菌體生長量低,不能有效降解其中的有機(jī)物和氨氮,另一方面,3 d后菌株很可能已處于衰亡期階段,細(xì)菌的死亡及自身的分泌物會導(dǎo)致餌料液中COD和N-N含量的增加。

3 討論

本研究利用刺參餌料配制的海水培養(yǎng)基作為唯一馴化分離篩選培養(yǎng)基,從刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境中分離篩選出1株能高效利用刺參餌料中COD和氨氮的優(yōu)良菌株DB11。該菌株主要來源于參池泥樣和刺參腸道樣中,水樣中含量很少未檢測到。在富集馴化過程中,刺參餌料質(zhì)量起始濃度為20 g/L,樣品連續(xù)富集馴化6次,7 d/次,并每次按10%的比例逐級增加餌料質(zhì)量,提高餌料滲出液濃度,篩選分離到能在高濃度餌料液中生長的優(yōu)勢菌種,為后續(xù)的篩選工作打好了基礎(chǔ)。菌株DB11經(jīng)過鑒定,為馬氏副球菌(Paracoccus marcusii),序列相似性達(dá)99.7%。通過對此菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的相關(guān)研究,確定了該菌株降解COD和氨態(tài)氮的動力學(xué)、最佳溫度和最佳p H以及餌料質(zhì)量濃度對其生長和餌料降解作用的影響。結(jié)果表明,該菌株在15～20℃(刺參生長攝食溫度)、p H=8.0～8.5、低接種量((1～5)×10-3)、3～5 d時間內(nèi)對1.0～20.0 g/L質(zhì)量濃度的刺參餌料浸出液都有很好的降解作用,氨氮的去除率幾乎達(dá)100%,COD的去除率也很高,說明菌株DB11對由于刺參餌料造成的有機(jī)物和氨氮污染具有高效降解作用,而且其大量存在于池塘底部,在刺參養(yǎng)殖池塘底質(zhì)修復(fù)方面有不可估量的作用。

本研究中的富集培養(yǎng)基是參考莫照蘭等[10]、俞勇等[14]文獻(xiàn)的方法,以20 g/L的刺參餌料質(zhì)量濃度浸泡而成,浸泡時間較長(2 d),以保證餌料中的可溶性有機(jī)物和氨氮完全浸出,力求接近刺參養(yǎng)殖池塘的自然狀況。浸泡后,可見刺參餌料完全變成了散泥沉在水底。經(jīng)采用堿性KMnO4法測定餌料浸出液的COD,其數(shù)值在1 g/L左右,高出上述文獻(xiàn)報(bào)道的對蝦餌料浸出液COD值的3～4倍,這可能與餌料種類及浸泡時間有關(guān)?？梢钥闯?菌株DB11對此刺參餌料浸出液中高濃度的有機(jī)物降解率達(dá)到一半以上,這一降解效果是非?？捎^的。通過以上分析,菌株DB11能高效降解刺參餌料,特別是高濃度的刺參餌料,能利用餌料中的有機(jī)物和氨態(tài)氮為C、N源快速生長,是一株優(yōu)良的刺參餌料降解菌株。

相關(guān)研究表明,在一定接種比例范圍內(nèi),接種比例越高,菌株對降解對象的去除率越高,而目前大多數(shù)研究在降解菌株的接種量方面都是以10～100×10-3的高比例進(jìn)行的[8,10-11,14]。在本研究中,為了力求與刺參養(yǎng)殖池塘菌密度的自然狀況相接近,菌株DB11采取了比較低的接種比例(1～5×10-3),接種后菌體密度一般在1.0×106cfu/mL左右。但在研究餌料質(zhì)量濃度對菌體生長以及COD、NH4-N降解影響中,接種比例設(shè)定為5×10-3,菌懸液菌體密度約為4.0×106cfu/mL,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株對20.0 g/L刺參餌料浸泡液中的有機(jī)物的去除率在3 d時間內(nèi)就達(dá)到了63.3%±0.80%,比先前50.0%±2.00%有了很大的提高。因此,可預(yù)見,若按照(10～100)×10-3的高比例接種,該菌株對餌料中的有機(jī)物和氨氮可能會有更好的去除效果。

本研究中發(fā)現(xiàn),盡管菌株DB11生長的最適溫度范圍為20～30℃,但其對餌料中有機(jī)物和氨氮的利用能力卻在15～20℃時更好,表明該菌株在低溫條件下更能有效地利用有機(jī)物和氨氮。而菌株DB11在20～30℃時的生長量稍高于15～20℃低溫條件下的生長量的原因,可能與在較高溫度下菌株可以額外利用餌料中的其它營養(yǎng)成分進(jìn)行生長有關(guān)。東秀珠等[16]對副球菌屬特征的描述指出,副球菌屬最適生長溫度在25～30℃之間,好氧,但當(dāng)硝酸鹽、亞硝酸鹽或氧化氮存在時,其能以它們的電子受體營厭氧生長。因此菌株DB11有可能在20～30℃時利用了餌料中的N、N或者其它營養(yǎng)成分進(jìn)行厭氧生長,從而獲得較高的生長量,具體情況有待進(jìn)一步研究。如果最終可以證實(shí)該菌株在高效利用有機(jī)物和氨氮的同時,還能夠有效利用亞硝酸鹽和硝酸鹽,那么其對刺參餌料將具有更徹底、更廣泛的降解作用。

本研究篩選得到的菌株DB11在15～20℃對餌料中有機(jī)物和氨氮具有較高的利用能力,表明該菌株在刺參養(yǎng)殖業(yè)中可能具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。眾所周知,刺參養(yǎng)殖的適宜水溫一般在15～20℃之間。在這一溫度范圍內(nèi),人工餌料的投喂比較集中,但由于大部分細(xì)菌的生長較慢,因此水體中的殘餌的分解率也較低,導(dǎo)致大量的殘餌積累在刺參養(yǎng)殖池塘中。而進(jìn)入高溫季節(jié)后,這些積累的殘餌會大量分解,不僅惡化底質(zhì)和水體環(huán)境,也嚴(yán)重影響即將或已進(jìn)入夏眠的刺參的生長和存活。因此,如果能將此菌株應(yīng)用到刺參養(yǎng)殖生產(chǎn)中,則可以及時降低刺參生長季節(jié)中池塘有機(jī)殘餌積累,大大減少高溫季節(jié)有機(jī)物分解對池塘環(huán)境的污染,從而有效緩解因環(huán)境惡化對刺參生長和存活造成的危害。

綜上所述,作者認(rèn)為菌株DB11是1株優(yōu)良的低溫刺參餌料降解菌,具有接種量低、降解效率高的特點(diǎn),在刺參養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中具有較大的潛在應(yīng)用價(jià)值。從其降解特性來看,不僅可以應(yīng)用于殘餌分布較多的刺參養(yǎng)殖池塘底質(zhì)的修復(fù),還可以應(yīng)用于人工餌料投喂較多的刺參工廠化養(yǎng)殖和育苗水體中,因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Isolation,Identification and Characterization of a Low-Temperature Degrading Bacterium

YAN Fa-Jun,TIAN Xiang-Li,DONG Shuang-Lin,NIU Yu-Feng
(The Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Educaion,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

A low-temperature bacterium named DB11 was isolated from sea cucumber outdoor culturing ponds with high degradation of organic-pollutants and ammonia-nitrogen.Physiological and biochemical tests and the 16S rDNA sequence similarity analysis indicated that strain DB11 was similar toParacoccus marcusii.When inoculated into the sea cucumber-feed-enrichment-medium by less than 5×10-3,strain DB11 was able to utilize 50%of COD and 98%of NH+4-N within five days at 15℃.Further degradation studies showed that the appropriate range of temperature and p H value for growth of strain DB11 was 15～30℃and p H 7～10,respectively,while the optimal temperature and p H value conditions for degradation of sea cucumber feed was 15～20℃and p H 8.0～8.5,respectively.Strain DB11 could decompose sea cucumber feed concentration of 10～20 g/L with 56.9%～65.7%of COD degradation rate,and feed concentration of 1～20 g/L with 91.7%～99.9%of NH+4-N degradation rate,respectively,within 3 days after inoculated by 5×10-3.

low-temperature bacterium;organic-pollutants;ammonia-nitrogen;isolation and identification;degrading characteristics

S917.1

A

1672-5174(2011)03-024-07

國家十一五科技支撐計(jì)劃課題(2006BAD09A01);國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z409);國家十一五支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD09A06);山東省自然科學(xué)杰出青年基金項(xiàng)目(JQ201009)資助

2010-02-22;

2010-06-25

閆法軍(1984-),男,博士生。E-mail:yanfajun2007@163.com

**通訊作者:Tel:0532-82032117;E-mail:xianglitian@ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)