試劑盒法檢測(cè)低乳糖牛奶中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法

劉美霞，張河霞，朱煒，王丹慧，李梅

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 011500）

試劑盒法檢測(cè)低乳糖牛奶中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法

劉美霞，張河霞，朱煒，王丹慧，李梅

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 011500）

為了提高檢驗(yàn)速度，降低檢驗(yàn)成本，特對(duì)現(xiàn)有乳糖試劑盒法進(jìn)行開(kāi)發(fā)，以滿足生產(chǎn)、檢驗(yàn)的需求。低乳糖牛奶由于乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較低，用現(xiàn)有的國(guó)標(biāo)滴定法無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)[1]，而色譜法需配備液相色譜儀，成本較高，且檢測(cè)速度比較慢，試驗(yàn)對(duì)原有乳糖檢測(cè)試劑盒進(jìn)行研究改進(jìn)，在其基礎(chǔ)上針對(duì)個(gè)別細(xì)節(jié)進(jìn)行了修訂，使原有方法更細(xì)化，從而快速檢測(cè)低乳糖牛乳中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[2]。本研究檢出限為3 g/kg。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠滿足在線生產(chǎn)及研發(fā)需求[3]。

試劑盒；低乳糖牛奶；乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)；檢測(cè)

0 引 言

牛奶是一種富含人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)素的食物。但是有些人喝了牛奶后會(huì)出現(xiàn)腸胃不適如腹脹、胃痛等癥狀，甚至發(fā)生腹瀉，這種現(xiàn)象即乳糖不耐癥[4]。為了避免這種現(xiàn)象，目前，大部分乳品企業(yè)研發(fā)生產(chǎn)出低乳糖牛奶[5]。目前用于檢測(cè)低乳糖牛奶中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法有限，現(xiàn)有國(guó)標(biāo)中滴定法不適用于低乳糖牛奶，而液相色譜法由于儀器較昂貴，檢測(cè)速度慢，不能滿足生產(chǎn)及研發(fā)的實(shí)際需求。迫切需要一種能夠簡(jiǎn)單、快速、成本低廉的檢測(cè)低乳糖牛奶中乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)方法，而市面上的試劑盒檢出限及回收率等各項(xiàng)指標(biāo)均未明確標(biāo)示，所以需對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證并改進(jìn)，以使乳品企業(yè)能夠廣泛應(yīng)用，提高檢驗(yàn)效率，降低檢驗(yàn)成本[6]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 器皿

容量瓶（50,100，500mL），一次性塑料比色皿（1 cm光路,3.0 mL），微量移液器（20 μL和200 μL），分析天平，分光光度計(jì)（設(shè)定在340 nm），定（計(jì)）時(shí)器；定量濾紙。

1.2 試劑

乳糖和半乳糖快速檢測(cè)試劑盒。

Carrez I溶液：取3.60 g亞鐵氰化鉀{K4[Fe（CN）6·]3H2O}溶于100 mL蒸餾水中，室溫保存。

Carrez II溶液：取7.20 g硫酸鋅（ZnSO4.7H2O）溶于100 mL蒸餾水中，室溫保存。

氫氧化鈉溶液：取4 g的NaOH溶于1 L蒸餾水中，室溫保存。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

在pH值為5.0的條件下，由β-半乳糖苷酶催化乳糖水解為D-半乳糖和D-葡萄糖；由半乳糖變旋酶（GaIM）催化，使α-D-半乳糖轉(zhuǎn)化為β-D-半乳糖；在pH值為8.6的條件下，由β-半乳糖脫氫酶（β-GaIDH）催化，β-D-半乳糖被NAD+氧化為D-半乳糖酸：根據(jù)該反應(yīng)生成的NADPH的量計(jì)算乳糖的量。通過(guò)測(cè)定340 nm處增加的吸光度值計(jì)算NADPH的量。

2.2 步驟

2.2.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g牛奶，至100 mL的容量瓶，再加50～60 mL的蒸餾水，混勻。加入2 mL Carrez I溶液，2 mL Carrez II溶液和4 mL NaOH溶液（100 mmol/L）。每一次加入后都要混勻，調(diào)節(jié)至室溫，用蒸餾水定容，混合，過(guò)濾。棄去最初幾毫升濾液，取清澈、可能略發(fā)乳白色的溶液用來(lái)檢測(cè)。

2.2.2 比色步驟

通過(guò)表1可以看出，樣品檢測(cè)時(shí)，每做一個(gè)樣品需使用4個(gè)比色皿進(jìn)行檢測(cè)，按此表順序，依次加入樣品溶液及藥品溶液于比色皿中，進(jìn)行兩次比色，記錄樣品吸光值。

2.2.3 比色條件

波長(zhǎng)為340 nm，比色皿為1 cm光路（玻璃或塑料），溫度≤25℃，終體積為2.72 mL。

2.2.4 計(jì)算

式中：0.3889和0.7389為取0.2 mL樣品溶液比色時(shí)的換算系數(shù)；V為取用來(lái)比色的樣品溶液體積；100為樣品定容體積（mL）；m為稱(chēng)樣量（g）。

2.3 結(jié)果判定

結(jié)果出具時(shí)，如檢測(cè)結(jié)果小于檢出限，則按小于檢出限出具，如檢測(cè)結(jié)果大于檢出限，為了確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，則需使用液相方法驗(yàn)證后，以液相法檢測(cè)結(jié)果出具。

3 結(jié)果與討論

（1）檢出限[7]：乳糖為3 g/L；半乳糖為2 g/L。

（2）回收率實(shí)驗(yàn)。選取8個(gè)點(diǎn)做回收率實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表1 比色步驟

表2 回收率實(shí)驗(yàn)

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

（3）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。分別取一個(gè)加標(biāo)樣品及一個(gè)低乳糖樣品做重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。通過(guò)上述檢測(cè)結(jié)果，乳糖及低乳糖樣品重復(fù)性實(shí)驗(yàn)效果比較好，符合要求。

（4）方法間比對(duì)。結(jié)果對(duì)比。取同一樣品同時(shí)使用國(guó)標(biāo)法（液相色譜法）與試劑盒法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。

通過(guò)試劑盒法與現(xiàn)有液相色譜法對(duì)同一樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，液相法檢測(cè)結(jié)果均為＜0.3%（即未檢出），而試劑盒法檢測(cè)結(jié)果也均＜0.3%，所以兩種方法結(jié)果一致。

方法間特性對(duì)比。分別對(duì)兩種方法特性進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比結(jié)果如表5所示。

4 結(jié) 論

（1）樣品中乳糖質(zhì)量濃度在3～60 g/L的情況下，回收率較好，當(dāng)大于60 g/L時(shí)，需對(duì)樣品進(jìn)行稀釋后檢測(cè)，使稀釋后的結(jié)果落在3～60 g/L范圍內(nèi)，計(jì)算時(shí)乘以稀釋倍數(shù)[8]。

（2）該方法檢出限：乳糖為3 g/L，半乳糖為2 g/L。

（3）用于低乳糖樣品檢測(cè)時(shí)，該方法與現(xiàn)有方法對(duì)比結(jié)果較一致，但對(duì)于乳糖質(zhì)量濃度較高的樣品檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，檢測(cè)時(shí)需將樣品進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)不合格的樣品，需用液相法進(jìn)行復(fù)檢后出具結(jié)果。

表4 低乳糖牛奶檢測(cè)結(jié)果%

表5 方法特性對(duì)比

（4）該方法的檢出限、回收率、精密度等實(shí)驗(yàn)結(jié)果均符合要求，且可以提高檢驗(yàn)效率，降低檢驗(yàn)成本，可以作為低乳糖牛奶中乳糖質(zhì)量濃度的快速篩查方法使用。

[1]GB 5413.5-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測(cè)定[S].

[2]顧新玲.乳糖酶的固定化及其生產(chǎn)低乳糖羊奶的實(shí)驗(yàn)研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2007.

[3]李文.β-半乳糖苷酶在液態(tài)奶中的應(yīng)用技術(shù)研究[D].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[4]曾果，黃承鈺，邱云青，等.健康成人牛奶不耐受癥的研究[C].乳糖酶及低乳糖乳制品專(zhuān)題研討會(huì)文集，2001.

[5]聶少萍，徐浩鋒，黃偉雄，等.青少年乳糖酶缺乏與氫呼氣量的研究[C].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)兒少衛(wèi)生分會(huì)第六屆全國(guó)學(xué)術(shù)交流會(huì)、中國(guó)健康教育協(xié)會(huì)學(xué)校分會(huì)第三屆學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集，2004.

[6]關(guān)曉輝，徐洪軍，張曉杰，等.不同年齡段人群乳糖酶缺乏的臨床研究[J].中華內(nèi)科雜志，2006（6）.

[7]GB/T5009.1-2003 A.2檢出限，A.2.2吸光法[S].

[8]GB/T20001.4-2001標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則，第4部分：化學(xué)分析方法[S].

Adulteration of raw milk in the qualitative determination of zinc salts

LIU Mei-xia，ZHANG He-xia，ZHU Wei，WANG Dan-hui，LI Mei
（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industrial Co.Ltd.,Hohhot 011500,China）

In order to improve the speed test，Reduce inspection costs，Special kit to existing law to develop lactose，To meet production、Needs test。Lactose content of low lactose milk is relatively low because，With the existing national standard titration method can not be detected，The chromatography to be equipped with liquid chromatography，High cost，And the detection of more slowly，Test the original study of lactose improved detection kit，Based on their individual details of the revised，So that the original method is more refined，To rapid detection of low-lactose milk lactose content。The detection limit was 3 g/kg。The results show that，The method is sensitive，ease of clinical，low system cost，system accuracy，To meet the needs of online production and R&D。

ELISA；Low-lactose milk；lactose content；detection

TS252.7

A

1001-2230（2011）07-0056-03

2011-05-30

劉美霞（1983-），女，碩士研究生，從事乳品檢測(cè)分析。