凝乳酶的研究進展

劉佟， 崔艷華，張?zhí)m威，曲曉軍

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

凝乳酶的研究進展

劉佟1， 崔艷華1，張?zhí)m威1，曲曉軍2

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010）

凝乳酶是一種最早在未斷奶的小牛胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，可專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結(jié)，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成為干酪生產(chǎn)中形成質(zhì)構(gòu)和特殊風(fēng)味的關(guān)鍵性酶，被廣泛地應(yīng)用于奶酪和酸奶的制作。本文以牛凝乳酶為例介紹了凝乳酶的結(jié)構(gòu)、理化特性和凝乳機理，綜述了凝乳酶主要來源以及不同來源凝乳酶之間酶性質(zhì)差異，旨在為凝乳酶研究提供些許參考。

凝乳酶；凝乳機理；凝乳酶來源；微生物源凝乳酶

0 引 言

隨著乳品行業(yè)的高速發(fā)展，人們對發(fā)酵乳制品的需求也日益增加。在干酪生產(chǎn)中，凝乳酶因其可以專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結(jié)，并由蛋白水解作用產(chǎn)生特有風(fēng)味，成為重點研究的酶制劑。但由于小牛凝乳酶無法滿足現(xiàn)代工業(yè)的需求且成本較高，國內(nèi)外學(xué)者致力于尋找動物源凝乳酶的替代品。隨著微生物源凝乳酶來源不斷擴大，基因技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸成為近年來的研究熱點。由于微生物源凝乳酶具有來源廣，生長周期短等優(yōu)點，是最具有發(fā)展?jié)摿Φ姆较颉?/p>

1 凝乳酶結(jié)構(gòu)與理化特性及凝乳機理

1.1 凝乳酶的結(jié)構(gòu)及理化特性

凝乳酶是一種酸性天冬氨酸蛋白酶，分子量介于32 000～49 000 u，主要有A，B，C三種形式，以B形式為主。A與B之間僅相差一個氨基酸位點，A的243氨基酸位點為Asp，而B為Gly，通常認(rèn)為A和B是由多態(tài)基因中的等位基因產(chǎn)生，而不是復(fù)等位基因雜交的結(jié)果。凝乳酶C是A的自我降解產(chǎn)物，由A自行切除3個殘基Asp244—Phe246而產(chǎn)生[1]。還有學(xué)者認(rèn)為，可以根據(jù)電泳淌度將凝乳酶（包括前凝乳酶原）分為A、B、C、D四種形式[2]。以小牛凝乳酶為例，凝乳酶一級結(jié)構(gòu)含有323個氨基酸殘基，有豐富的二羧基氨基酸和β-羥氨基酸[3]；二級結(jié)構(gòu)主要是大量的β折疊和少量的α螺旋；三級結(jié)構(gòu)是大小為40?×60?×65?的晶體，由N端區(qū)域和C端區(qū)域以雙葉折疊形式形成了帶有兩個活性位點Asp32和Asp215的分裂溝。同時在凝乳酶中含有3個二硫鍵，分別位于45～50，206～210和249～282，對酶的活性有重要的影響。

凝乳酶的溶解度受pH值、溫度和溶液離子強度影響?？扇苡趐H值為5.5，濃度為1 mol/L的NaCl溶液，晶體結(jié)構(gòu)的凝乳酶在25℃比較穩(wěn)定，且溶解度隨離子強度增強而增強。凝乳酶的等電點為pH值為4.5，在pH值為5.3～6.3最穩(wěn)定，但pH值為3～4時會因自身降解而活性降低。堿性條件下會發(fā)生不可逆的構(gòu)象變化而使活性降低。組氨酸的氧化作用和賴氨酸的ε-氨基的改變也會輕微影響酶活。在37℃，濃度為4.6 mol/L的尿素培養(yǎng)30 min后其酶活力會降低約一半。另外晶形凝乳酶最為穩(wěn)定。

1.2 凝乳酶的凝乳機理

乳中主要存在αS1-酪蛋白 （αS1-CN）、αS2-酪蛋白（αS2-CN）、β-酪蛋白（β-CN）及κ-酪蛋白（κ-CN）4種酪蛋白。αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白是疏水蛋白質(zhì)，能夠被鈣離子沉淀，而κ-酪蛋白對鈣離子不敏感，并能夠形成保護層得到穩(wěn)定的酪蛋白膠束，從而抑制了α和β酪蛋白的沉淀[5]。酪蛋白膠束本身是由許多直徑為80～300 nm的酪蛋白粒子聚合而成，酪蛋白自我聯(lián)合擴大形成微膠粒，由κ-酪蛋白附著于表面來保持穩(wěn)定性[6]。凝乳酶的凝乳作用分為兩個步驟：第一步是酶專一性的水解乳中κ-酪蛋白多肽鏈的Phe105-Met106之間的肽鍵，形成穩(wěn)定副κ-酪蛋白及親水性糖巨肽；第二步是當(dāng)總的κ-酪蛋白被水解掉約80%時，在鈣離子存在下通過在酪蛋白膠粒間形成的化學(xué)鍵形成凝塊或凝固的乳。這是由于κ-酪蛋白分子位于酪蛋白膠束表面，亞基之間以疏水鍵和膠體磷酸鈣相互作用的方式連接在一起。酪蛋白在凝乳酶的作用下，酪蛋白膠粒表面的κ-酪蛋白分子層部分分解，內(nèi)部的α，β-酪蛋白失去膠體保護作用成為副酪蛋白，并在鈣離子存在下形成不溶性凝塊[3,5，6]。

2 凝乳酶的來源

2.1 動物源凝乳酶

凝乳酶最早來源于小牛的第四胃黏膜。Longenbach等闡述了小牛凝乳酶凝乳的生理功能和重要性，反應(yīng)出凝乳酶的一些生理特性。但由于無法滿足現(xiàn)代工業(yè)的需求且成本較高，先后開發(fā)了多種皺胃酶替代品[7]。研究者連續(xù)從其他動物（如豬、羊、狗等）的胃中提取凝乳酶，并通過實驗研究證明羔羊皺胃酶凝乳性較低可用乳豬胃酶替代，效果十分理想。Shahidi在格陵蘭海豹和鯉魚的胃中也提取得到了凝乳酶[8]。不同動物來源的凝乳酶的特性存在一定的差異，例如Kumar等人[9]從山羊胃中提取凝乳酶，經(jīng)純化后研究發(fā)現(xiàn)該凝乳酶的熱穩(wěn)定性高于黃牛凝乳酶，其穩(wěn)定性與水牛凝乳酶類似。另外在水生動物中也能提取凝乳酶制劑，Shahidi[10]從水生動物中提出多種蛋白酶，其中就包括凝乳酶。由于動物來源的凝乳酶來源不穩(wěn)定，同時出于對種族、信仰等方面的考慮，研究者已將研究方向轉(zhuǎn)為微生物和植物來源的凝乳酶。

表1 凝乳酸特性及凝乳最適條件

2.2 植物源凝乳酶

許多植物中含有能使乳凝固的蛋白酶，來源非常廣泛。目前研究較多的有如下幾種，包括木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶，合歡蛋白酶，朝鮮薊蛋白酶等[11]。Chazarra S等人[12]利用朝鮮薊（洋薊）提取出3種有凝乳能力的朝鮮薊蛋白A，B，C作為添加物或替代牛凝乳酶制作干酪，其凝乳能力主要受pH值和溫度的影響。同時對A，B，C三種蛋白的凝乳特性進行了比較，發(fā)現(xiàn)純化步驟使A和C的凝乳能力降低，B反而升高，具有更高的活性；從荊棘薊中獲得的凝乳酶多用于La Serena干酪的制作[13]。在干酪生產(chǎn)應(yīng)用方面，Maria和Malcata證明了植物來源的凝乳酶分解脂肪的能力完全可以替代動物源凝乳酶[14]。研究表明植物蛋白酶有較好的凝乳性，但因水解活力高，在乳制品加工中常出現(xiàn)苦澀感，同時要受到時間、空間、生長周期等諸多條件限制，發(fā)展有一定的局限性。

2.3 微生物源凝乳酶

微生物因其具有生長周期短，產(chǎn)量高，受時間、空間限制小，生產(chǎn)成本低，提取方便，經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，是目前凝乳酶來源最有前途的發(fā)展方向。目前已發(fā)現(xiàn)有40余種微生物可生產(chǎn)一定活力的凝乳酶，主要是真菌、放線菌、細(xì)菌等。表1為微生物來源凝乳酶特性及凝乳最適條件。

自1968年Arima發(fā)現(xiàn)真菌微小毛霉（Mucor pusillus）可產(chǎn)生高活力的凝乳酶后，國外研究者對真菌來源凝乳酶進行了大量研究。研究者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)毛霉屬、曲霉屬等真菌可產(chǎn)凝乳酶。我國也在20世紀(jì)80年代后期開始對微生物源凝乳酶進行研究[25]。目前廣泛得到應(yīng)用的微生物有微小毛霉、米黑根毛霉、米曲霉、栗疫菌和枯草芽孢桿菌等。郭光遠等在云南不同地區(qū)，從土樣和湖泊底泥中分離出2 500余種菌，最終篩選出一株細(xì)菌（枯草芽孢桿菌）和一株真菌（毛霉Y85-8512），酶活力分別達到10 000 U/g和5 000 U/g以上[26]。目前在干酪生產(chǎn)中有1/3都是利用微生物來源的凝乳酶，微生物源凝乳酶最大的一個缺點就是在干酪制作中產(chǎn)生的一些不良風(fēng)味和苦澀感。

2.3.1 微小毛霉

對于微小毛霉（Mucor pusillus）產(chǎn)凝乳酶的研究，始于1968年。Arim從微小毛霉中提取凝乳酶，并利用離子交換樹脂CG-50，葡聚糖凝膠電泳SephadexA-50和Sephadex100純化粗酶，并使其晶體化。Arim又于1970年對微小毛霉產(chǎn)凝乳酶的特性進行一系列測定，發(fā)現(xiàn)其具有高活力，酶活可達到4 650個酶活力單位。Nouani A等人以工業(yè)生產(chǎn)的角度從微小毛霉提取純化出凝乳酶，并以熱穩(wěn)定性、pH值、CaCl2對凝乳能力影響、蛋白水解活力幾個方面與傳統(tǒng)動物源凝乳酶進行比較。結(jié)果證明除了最適溫度為50℃，相對于傳統(tǒng)凝乳酶的42℃有較大差距，其他特性與傳統(tǒng)動物源凝乳酶極為相似，可作為動物來源凝乳酶的替代品用于工業(yè)生產(chǎn)。微小毛霉凝乳酶分子量為49 000 u，最適溫度50℃，在65℃下加熱30 min后酶完全失活[15]。在我國，高維東等人也對微小毛霉（HL-1）凝乳酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，發(fā)現(xiàn)可用于凝乳酶干酪素和奶酪的生產(chǎn)[16]。

2.3.2 米黑根毛霉

米黑根毛霉（Mucor miehei）產(chǎn)凝乳酶因其R值（凝乳活力與蛋白水解能力之比）較高，獲得的高質(zhì)量和高產(chǎn)量的干酪產(chǎn)品，廣泛應(yīng)用于工業(yè)凝乳，當(dāng)前主要是利用深層發(fā)酵獲得米黑根毛霉凝乳酶。Beyenal H等人[27]對米黑根毛霉NRRL 3420進行補給D-葡萄糖、無pH值控制長時間連續(xù)發(fā)酵，確定了操作條件，同時也對凝乳酶應(yīng)用價值進行分析，其極高的R值具有很大的應(yīng)用價值。之后，Lima C J等又對米黑根毛霉NRRL 3420產(chǎn)凝乳酶的深層培養(yǎng)條件進行研究，利用干酪乳精中的乳糖和葡萄糖作為碳源對產(chǎn)量的影響，通過響應(yīng)面方法確定了產(chǎn)酶活力最高為1200 SU，組成質(zhì)量濃度為20 g/L葡萄糖，4 g/L酪蛋白在pH值為4的條件下培養(yǎng)。其中，糖原對酶活力影響最大[28]，并且Silveira1 G G等[17]認(rèn)為相對于蛋白胨來說，玉米漿是更好的氮源。米黑根毛霉產(chǎn)凝乳酶主要應(yīng)用于卡門伯特乳酪、伊丹乳酪和切達干酪[18]。

2.3.3 曲霉

曲霉屬中米曲霉、黑曲霉、紅曲霉等均可以產(chǎn)凝乳酶，其中米曲霉研究與應(yīng)用比較廣泛。我國具幾千年的發(fā)酵文化，在國內(nèi)對中國曲產(chǎn)凝乳酶的研究較多。吳進菊從中國曲中分離出酒曲根霉F34菌株，利用Sephadex75純化粗酶，研究得出F34菌株凝乳酶最適反應(yīng)溫度為50℃，pH值為5.5，Ca2+、Zn2+、Fe2+和Fe3+對凝乳活力有明顯促進作用，K+和Mg2+對凝乳活力有微弱的促進作用， 而Na+、Cu2+、Co2+和Li2+對凝乳活力有明顯抑制作用[29]。又于2009年對中國曲中凝乳酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究，確定了F34菌株產(chǎn)凝乳酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：米粉麩皮水解液4.5%，豆粉水解液4.0%，CaCl20.3%，KCl 0.5%（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；最適發(fā)酵條件：初始pH值為4.5；發(fā)酵溫度為34℃；培養(yǎng)時間為60 h[30]。邵淑娟等對產(chǎn)凝乳酶黑曲霉JG用微波輻照的方法誘變處理，在酪蛋白培養(yǎng)基上以凝乳圈直徑為指標(biāo)進行初篩；在基礎(chǔ)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上復(fù)篩，選育出具有遺傳穩(wěn)定性的突變株WB6-3和WB2-5，其凝乳活力分別提高了35%和14%[31]。范素琴采用酪蛋白平板法和Arima時間法篩選出1株產(chǎn)生凝乳酶能力強的菌株M5，并通過正交試驗對該霉菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化[32]。

2.3.4 栗疫菌

栗疫菌 （Endothia parasitica）產(chǎn)凝乳酶研究相對較少。Sardinas J L在381株細(xì)菌和540株真菌中篩選出了一株栗疫菌可產(chǎn)凝乳酶。栗疫菌凝乳酶具有晶體構(gòu)型，能夠溶于水和有機溶劑；分子量在34 000～39 000 u；等電點為pH值為4.5；在60℃下加熱5 min便完全失活；在pH值為5的水溶液中最為穩(wěn)定。在凝乳酶的蛋白水解作用中，栗疫菌凝乳酶能夠產(chǎn)生丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸等多種氨基酸，但不能產(chǎn)生色氨酸[21]。

2.3.5 枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種非常重要的產(chǎn)酶菌，主要得益于它能夠產(chǎn)生和分泌大量胞外酶。雖然當(dāng)前枯草芽孢桿菌并非主要微生物來源凝乳酶產(chǎn)生菌，但因其在焙烤食品中有較高凝乳活力，所以枯草芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶相關(guān)研究具有深遠意義[24]。胡永金等從云南某地奶牛場土壤中分離出22株R值較高的產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌。通過觀察形態(tài)、生理生化實驗、16sRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析確定該菌株為枯草芽孢桿菌[33]。丁明亮等對枯草芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件通過單因素試驗和響應(yīng)面法進行了優(yōu)化，得出最優(yōu)發(fā)酵工藝：葡萄糖添加量16.2 g/L（質(zhì)量濃度）、接種量0.130%（體積分?jǐn)?shù)）、發(fā)酵時間120.34 h，所得酶活力（1129.05±74.55）SU/mL[34]。

2.4 基因工程凝乳酶

基因工程凝乳酶即將凝乳酶基因連接到合適載體并轉(zhuǎn)入宿主中所表達產(chǎn)生的酶。目前最常用的宿主是大腸桿菌（Esherichia coli），但是表達的凝乳酶主要以包涵體的形式，需要復(fù)性，因此增加了成本。以釀酒酵母為宿主，可形成20%可直接利用的可溶性凝乳酶原，另外80%殘留于細(xì)胞殘片[35]。Maria將凝乳酶原在釀酒酵母中表達出來，可以作為山羊凝乳酶的替代品[36]。Stefan利用在黑曲霉中表達，發(fā)酵產(chǎn)生單駝峰凝乳酶，經(jīng)過與小牛凝乳酶比較發(fā)現(xiàn)，重組單駝峰凝乳酶的凝結(jié)能力高于小牛凝乳酶70%，且有更高的的耐熱穩(wěn)定性[37]。之后Bansa利用這一結(jié)論使用重組單駝峰凝乳酶加工Cheddar干酪，根據(jù)干酪特性與傳統(tǒng)方法進行比較，顯示出并無明顯差異[38]。此外，絲狀真菌、微小毛霉、米黑根毛霉、構(gòu)巢曲霉都適用于轉(zhuǎn)入凝乳酶基因[39]。

3 結(jié)束語

本文綜述了不同來源的凝乳酶及其相應(yīng)的酶學(xué)性質(zhì)，微生物源凝乳酶因周期短，產(chǎn)量高，受時間、空間限制小，生產(chǎn)成本低，提取方便，經(jīng)濟效益高等優(yōu)點，是目前凝乳酶來源最有前途的發(fā)展方向，開發(fā)可產(chǎn)凝乳酶的新菌株和誘變產(chǎn)生高產(chǎn)菌株將成為日后的研究熱點。隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程凝乳酶除具有傳統(tǒng)凝乳酶的優(yōu)點之外，還可根據(jù)需求進行改造，因此具有不可估量的發(fā)展前景。隨著我國消費者對干酪的認(rèn)識不斷加深，健康消費觀念的普及，干酪產(chǎn)業(yè)具有極大的市場潛力，也為凝乳酶的工業(yè)化提供了發(fā)展機遇。

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Research advancement of chymosin

LIU Tong1,CUI Yan-hua1，ZHANG Lan-wei1,QU Xiao-jun2
（1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Microbiology,Heilongjiang Science Academy,Harbin 150010,China）

Chymosin（rennin;EC 3.4.23.4）belongs to a aspartic proteinase family which was found in unweaned bovine stomachs at first.It can specifically cleave the κ-casein at the Phe105-Met106peptide bond to broke the casein micelles causing milk-clotting.In cheese production,chymosin plays an important role as the key enzyme in milk-clotting and processing of texture and flavour.The structure,physicochemical characteristics and milk coagulation mechanism of bovine chymosin were reviewed in this paper.Otherwise,the source of chymosin and the diversity from different sources were discussed.

chymosin;milk coagulation mechanism;chymosin source;microbial chymosin

Q935

B

1001-2230（2011）08-0040-04

2011-06-07

國家自然科學(xué)基金資助項目（30901048）。

劉?。?987-），女，碩士研究生，主要從事分子微生物學(xué)研究。

張?zhí)m威