不同頻率正弦波振動對大鼠廢用性肌萎縮的對抗作用

石 磊，曹若男，樊小力，陳龍偉

●成果報告

不同頻率正弦波振動對大鼠廢用性肌萎縮的對抗作用

石 磊1，曹若男2，樊小力3，陳龍偉1

目的：探討正弦波振動（HFV）對制動大鼠肌肉萎縮的對抗作用。方法：以大鼠后肢制動為廢用模型，對振動組大鼠施以不同頻率的HFV，觀察大鼠比目魚?。⊿OL）濕重體重比、肌纖維橫截面積、梭外肌纖維構成比以及梭內(nèi)肌纖維肌球蛋白重鏈（MHC）的表達的變化。結果：（1）制動14 d后，SOL濕重體重比、肌纖維橫截面積以及梭外?、裥图±w維的構成比明顯下降，Ⅱ型肌纖維的構成比明顯增加，梭內(nèi)肌纖維MHC的表達有所增強；（2）施加HFV后，SOL濕重體重比、肌纖維橫截面積和Ⅰ型肌纖維的構成比明顯上升，Ⅱ型肌纖維的構成比明顯下降，梭內(nèi)肌纖維MHC的表達正常。結論：HFV可對抗廢用后SOLⅠ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉化和梭內(nèi)肌MHC表達有增強的趨勢，且以200 Hz HFV組最為顯著。

高頻正弦波振動；肌球蛋白重鏈；肌梭

運動減退、制動或肌肉去負荷，均可使骨骼肌出現(xiàn)明顯的廢用性萎縮[1-2]，肌纖維的重量及橫截面積均發(fā)生明顯改變，這種改變對人體的技能提高和恢復效率乃至運動壽命會產(chǎn)生深遠的影響[3-6]。因此，隨著我國體育事業(yè)的發(fā)展，尋找和制定更為安全有效的防護措施具有重要意義。

肌梭的傳入放電減少是廢用性肌萎縮發(fā)生的重要原因之一[7-8]。因此我們推論，如某種方法可以使肌梭的傳入增強，則在理論上能夠對抗廢用性肌萎縮。研究表明，高頻正弦波振動（HFV）可以選擇性地興奮肌梭[9-12]。為此，我們以大鼠后肢伸長位制動為廢用動物模型，采用短時間歇式振動的方法，結合免疫組化染色法檢測，觀察50 Hz、200 Hz和400 Hz HFV對制動大鼠比目魚?。⊿OL）濕重體重比、肌纖維橫截面積、梭外肌纖維的構成比以及梭內(nèi)肌纖維MHC表達的影響，探討其對廢用性肌萎縮的對抗作用，為尋找預防和治療廢用性肌萎縮的有效措施提供資料。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物及分組

將健康雌性Sprague-Dawley品系大鼠按體重配對原則分為5組（西安交大醫(yī)學院實驗動物中心提供，體重為230～240 g，每組7只動物）：正常同步對照組（CON），制動（IMM）14天組，制動+50 Hz振動（IMM+50 Hz HFV）14天組，制動+200 Hz振動（IMM+100 Hz HFV）14天組，制動+400 Hz振動（IMM+200 Hz HFV）14天組。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[13]。

1.2 制動動物模型

應用傳統(tǒng)模型并加以改進[14]：將大鼠進行腹腔麻醉，在大鼠左后肢的彎曲部位（神經(jīng)和血管較為密集且易受壓位置）墊以棉層，最終用石膏繃帶包扎動物后肢，將其固定在踝關節(jié)背伸（約45°）而膝關節(jié)伸展（約180°）位，使SOL處于伸長位。

1.3 振動方法

在SOL肌腹部位采取短時多次的間歇式振動方法進行振動（50 Hz、200 Hz和400 Hz，300 μm，14天）。振動刺激詳盡環(huán)節(jié)如下：每振動1 min后間歇1 min，重復4次后間歇2 min，此為一個振動周期，一個振動點每周期振動時間總計4 min（不包括間歇時間），每次重復振動3個周期，每天進行4次振動。

1.4 MHC表達的免疫組化染色檢測

將大鼠進行腹腔麻醉，稱體重后經(jīng)升主動脈行血管灌注固定。灌注后立即取出大鼠左下肢SOL，稱重并剪修肌肉（以100 g體重標化計算比目魚肌濕重體重比，MWW/BW），然后浸于多聚甲醛固定液（40 g/L，4℃）中過夜，以垂直位行石蠟包埋。石蠟切片以接近肌腹的橫截面（厚度為5 μm）為優(yōu)選。研究采取抗快縮型MHC抗體（一抗為MY－32，購自Sigma公司；二抗為抗小鼠IgG，購自Vector公司），參照傳統(tǒng)ABC法進行免疫組化染色。

1.5 統(tǒng)計學分析

實驗應用 Image－Pro PLUS圖象分析系統(tǒng)（MEDIA CYBERNETICS）對各型肌纖維的細胞數(shù)進行定量分析，測定每個視野內(nèi)各型肌纖維數(shù)，并計算各型肌纖維的構成比和肌纖維的橫截面積（CSA），求出每組動物的均值。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件中的單因素方差分析法（ANOVA）進行統(tǒng)計分析。實驗結果以均數(shù)±標準差（±S）表示，取P＜0.05作為統(tǒng)計學差異的界值。

2結 果

2.1 HFV對制動大鼠梭外肌纖維MHC表達及顯微結構的影響

大鼠行制動實驗14天后，梭外肌快縮型MHC的表達與CON組相比有所增強，SOL肌纖維的構成比有明顯改變，Ⅰ型肌纖維（慢?。┑臉嫵杀葴p少，由86%減少到70%，Ⅱ型肌纖維（快?。┑臉嫵杀仍黾樱?4%增加到30%，IMM組I、II型肌纖維的平均橫截面積以及比目魚肌濕重體重比均有所下降，與CON組對比有顯著性差異（P＜0.05）。這表明制動使SOL有了慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。IMM組SOL梭外肌纖維結構特征：肌束狀結構紊亂，肌纖維間隙加大，肌內(nèi)膜下結締組織大量增生，有呈病灶性表現(xiàn)的傾向。振動組與IMM組的染色結果相比，Ⅰ型肌纖維的構成比明顯上升，同時Ⅱ型肌纖維的構成比明顯下降（P＜0.05），其中以IMM+200 Hz HFV組的變化最為明顯。振動組I、II型肌纖維的平均橫截面積以及比目魚肌濕重體重比與CON組對比均有所下降，但無顯著性差異（P＞0.05，見表1）。結果提示，在制動期間對大鼠施加HFV可以對抗因制動而引起的梭外慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。

表1 HFV對模擬廢用大鼠SOL梭外肌纖維的對抗作用Tab.1 Effects of HFV on expression of MHC in ertrafusal fibers in soleus muscles of rats with immobilization（n=7，±S）

表1 HFV對模擬廢用大鼠SOL梭外肌纖維的對抗作用Tab.1 Effects of HFV on expression of MHC in ertrafusal fibers in soleus muscles of rats with immobilization（n=7，±S）

注：*P＜0.05，與CON組相比；#P＜0.05，與IMM相比。

組別 MWW/BW CSAⅠ/μm2 CSAⅡ/μm2 Prcentage ofⅠfibers/% Prcentage ofⅡfibers/% CON 43.78±4.25 2 587.01±91.23 1 793.46±89.91 13.69±2.13 86.31±2.67 IMM 3194±3.07* 1 904.57±81.04* 1 387.43±92.65* 30.48±3.14a 69.52±3.01a IMM+50 HzHFV 38.91±2.86# 2 289.32±83.57# 1 504.47±84.08# 21.49±2.87# 78.51±2.98# IMM+200 Hz HFV 41.65±4.13# 2 461.14±90.78# 1 639.25±89.41# 16.93±2.91# 83.07±2.87# IMM+400 Hz HFV 39.04±5.12# 2 354.59±87.63# 1 594.56±84.38# 18.16±2.93# 81.84±2.72#

2.2 HFV對制動大鼠梭內(nèi)肌纖維MHC表達及顯微結構的影響

在CON組SOL肌梭的染色結果可以觀察到：核袋Ⅰ纖維內(nèi)無著色沉淀（陰性肌纖維）；核袋Ⅱ纖維多無著色沉淀（陰性肌纖維），少數(shù)有淺褐色沉淀（弱陽性肌纖維）；而核鏈纖維內(nèi)則出現(xiàn)棕色沉淀（陽性肌纖維）。CON組SOL肌梭結構特征：被囊膜完整，軸周間隙結構正常，核袋和核鏈纖維區(qū)分明顯。在IMM組SOL肌梭的染色結果可以觀察到：核袋Ⅰ纖維內(nèi)依然無著色沉淀（陰性肌纖維）；核袋Ⅱ纖維多有褐色沉淀（陽性肌纖維）；而核鏈纖維內(nèi)則出現(xiàn)深棕色沉淀（強陽性肌纖維）。這表明制動使梭內(nèi)肌呈現(xiàn)了慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。IMM組大鼠SOL肌梭結構特征：梭內(nèi)肌破壞嚴重，部分肌膜溶解消失，軸周間隙增寬，內(nèi)囊壁部分腫脹溶解。振動組大鼠梭內(nèi)肌纖維著色及顯微結構的變化近于正常而無顯著的病灶傾向（見圖1）。結果提示，在制動期間對大鼠施加HFV可以對抗因制動而引起的梭內(nèi)慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。

3 討 論

MHC是骨骼肌纖維中最重要的肌原纖維蛋白之一，含有與肌肉收縮速度有關的酶活性，維持肌細胞結構的完整性。骨骼肌纖維至少表達6種表型的MHC：MHCⅠ/beta cardiac MHC；MHCⅡa；MHCⅡb；MHCⅡd/x；MHC embryonic；MHC fetal/ neonatal，其表型的變化必然會影響肌纖維的代謝和功能特性。本實驗選用以兔的快肌纖維作為免疫源而得到的MHC抗體僅檢測快肌MHC的一個表位，可以同梭內(nèi)、外肌纖維中快肌纖維的所有亞型發(fā)生免疫反應，同慢肌則不發(fā)生反應。研究表明，在廢用狀態(tài)下，SOL（典型慢?。l(fā)生明顯的萎縮，慢氧化型纖維數(shù)量明顯減少，而中間型、快氧化型和酵解型纖維數(shù)量卻增加。我們的實驗結果與前期的文獻報道一致：廢用14天后，SOL梭外肌纖維MHC的表達水平和表型發(fā)生了改變，Ⅰ型肌纖維的構成比明顯減少，Ⅱ型肌纖維的構成比明顯增加，出現(xiàn)了Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉化的趨勢。

肌梭與骨骼肌在發(fā)生學上有著相同的起源與血供來源，與梭外肌為同一反射弧的不同部分。核袋Ⅰ纖維的代謝特點類似慢肌，而核袋Ⅱ纖維和核鏈纖維則類似快肌。國外學者曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌肉制動不但可引起肌肉本體感受器的傳入沖動減少，而且肌梭的核袋和核鏈纖維的橫截面積也會相應減少[15-18]。本研究結果顯示：廢用14天后，SOL肌梭的核袋Ⅰ纖維中MHC的表達仍呈陰性，核袋Ⅱ纖維出現(xiàn)由陰性向陽性的轉化，核鏈纖維MHC的表達有所增強，這表明制動使梭內(nèi)肌呈現(xiàn)了慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。

將HFV作為外界機械刺激可以提高肌梭的興奮性，使肌梭的傳入放電活動增強，因此HFV常作為一種肌梭敏感性的研究手段，但其作為廢用性肌萎縮的對抗措施卻少見研究。國外學者發(fā)現(xiàn)[19]，對大鼠跟腱施以120 Hz的HFV，可以明顯地對抗大鼠失重性肌萎縮的癥狀。另有研究證實，振動動物的肌肉可以使其初級傳入末梢的興奮性增強，而且還能夠增強其某些次級傳入末梢的興奮性，而振動肌腱則僅限于對初級傳入末梢興奮性的增強。因此，考慮到能夠更大程度地興奮肌梭，我們所采用的振動部位與前者有所不同，即由肌腱轉為了肌腹。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，這種肌肉振動方法對制動引起的廢用性肌萎縮的具有一定的對抗作用，可使肌梭的傳入沖動增加，可以減緩制動大鼠SOL肌纖維橫截面積和濕重體重比的減少趨勢。本次MHC染色結果顯示，在大鼠制動期間給予HFV后，SOL梭外肌Ⅰ型肌纖維的構成比明顯上升，同時Ⅱ型肌纖維的構成比明顯下降，其中以IMM+200 Hz HFV組的變化最為明顯。振動組SOL梭內(nèi)肌纖維中MHC表達及顯微結構的改變均不明顯，接近于正常大鼠。結果提示，在制動期間對大鼠施加HFV可以有效地對抗因制動而引起的梭內(nèi)、外慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢，這與前期的研究結果是一致的；而相對于50 Hz和400 Hz的HFV，肌梭對于200 Hz的振動可能更為敏感。

從以上方面分析，我們認為，HFV對于廢用性肌萎縮具有對抗作用，根本原因是由于HFV對肌梭興奮性的誘發(fā)作用。推測其機制為：HFV誘使肌梭的Ia類和Ⅱ類傳入纖維的興奮性增強，加大了肌梭傳向中樞的傳入沖動總量，通過γ和α神經(jīng)活動，強化了肌肉運動單位的參與程度，增大了骨骼肌活動的量與強度，改善了梭外肌的代謝環(huán)境，從而維持了肌肉的正常結構與功能狀態(tài)，最終實現(xiàn)對肌肉萎縮的對抗作用。本研究發(fā)現(xiàn)HFV可對抗廢用后SOLⅠ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉化和梭內(nèi)肌MHC表達有增強的趨勢，且以200 Hz HFV組最為顯著。HFV作為一種對抗廢用性肌萎縮的有效措施提供了有力的實驗依據(jù)。

[1]Ventadour S，Attaix D.Mechanisms of skeletal muscle atrophy[J].Curr Opin Rheumatol，2006，18（6）：631-635.

[2]Caron AZ，Drouin G，Desrosiers J，et al.Anovel hindlimb immobilization procedure for studying skeletal muscle atrophy and recovery in mouse[J].Appl Physiol，2009，106（6）：2 049-2 059.

[3]Sugiura T，Ito N，Goto K，et al.Estrogen administration attenuates immobilization-induced skeletal muscle atrophy in male rats[J].Physiol Sci Dec，2006，56（6）：393-399.

[4]Farthing J P，Krentz J R，Magnus C R.Strength training the free limb attenuates strength loss during unilateral immobilization[J].Appl Physiol，2009，106（3）：830-836.

[5]Mattiello-Sverzut A C，Carvalho L C，Cornachione A，et al. Morphological effects of electrical stimulation and intermittent muscle stretch after immobilization in soleus muscle[J].HistolHistopathol，2006，21（9）：957-964.

[6]李玉章.不同形式振動訓練中下肢肌群的神經(jīng)肌肉激活特征[J].天津體育學院學報，2011，26（1）：30-33.

[7]石磊，廉西娟，王保成，等.運動補劑增強蟾蜍離體單一肌梭傳入放電頻率[J].體育科學，2006，26（2）：55-63.

[8]KawanoF，TakenoY，Nakaln，et al.Essential role of satellite cells in the growth of rat soleus muscle fibers[J].Am J Physiol Cell Physiol，2008，295（2）：458-467.

[9]Adams G R，Haddad F，Bodeil P W，et al.Combined isometric，concentric，and eccentric resistance exercise prevents unloading-induced muscle atrophyin rats[J].Appl Physiol，2007，103（5）：1 644-1 654.

[10]Fallon J B，Macefield V G.Vibration sensitivity of human muscle spindles and Golgi tendon organs[J].Muscle Nerve，2007，36（1）：21-29.

[11]RollJP，AlbertF，ThyrionC，etal.InducingAnyVirtualTwo-Dimensional Movement in Humans by Applying Muscle Tendon Vibration[J].J Neurophysiol，2009，101（2）：816-823.

[12]Albert F，Bergenheim M，Ribot-Ciscar E.The afferent feedback of a given movement evokes the illusion of the same movement when returned tothe subject via muscle tendon vibration[J].Exp Brain Res，2006，172（2）：163-174.

[13]中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見[M].北京：中華人民共和國科學技術部，2006.

[14]Booth F W，Kelso J R.Production of rat muscle atrophy by cast fixation [J].Appl Physiol，1973，34（2）：404-406.

[15]Zhu Y J，Wu S D，F(xiàn)an X L，et al.Influence of hindlimb unloading on the morphologyofnerve endings in soleus muscle spindles[J].Space Med Med Eng，2006，19（2）：95-98.

[16]閆萬軍，趙斌，劉豐彬，等.衰老肌細胞的組織學特征研究[J].天津體育學院學報，2009，24（3）：212-215.

[17]Gómez-Pinilla F，Ying Z，Roy R R，et al.Afferent input modulates neurotrophins and synaptic plasticityin the spinal cord[J].Neurophysiol，2004，92（6）：3 423-3 432.

[18]Tang B，F(xiàn)an X L，Wu S D，et al.Influence of simulated weightlessness on the morphology of nerve endings of in muscle spindles in rat soleus muscle[J].Space Med Med Eng，2003，16（3）：162-164.

[19]Falempin M，In-Albon S F.Influence of brief daily tendon vibration on rat soleus muscle non-weight-bearing situation [J].Appl Physiol，1999，87（1）：3-9.

Antagonistic Effects of Different Frequency Sinusoidal Vibration Given To Disused Muscle Atrophy in Rats

SHI Lei1，CAO Ruonan2，F(xiàn)AN Xiaoli3，CHEN Longwei1
（1.Dept.of PE，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710049，China；2.School of Foreign Languages，Northwest University，Xi'an 710069，China；3.Dept.of Physiology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China）

Objective：To study the antagonistic effects of different frequency sinusoidal vibration given to disused muscle atrophy in rats under immobilization.Methods：The rats were made into models of disused muscles through the immobilization in their hindlimbs.HFV were applied to the immobilized soleus muscles in the vibration group.The ratio of muscle wet weight to body weight of the soleus muscles，the cross-sectional area，the constituent ratio of skeletal muscle fibers and changes of expression of MHC in intrafusal and extrafusal fibers were detected.Results：①After the 14-day immobilization period，the SOL fibers showed an evident shift toward a decreased percentage of fibers typeⅠ，but an increased percentage of typeⅡ.The expression of MHC in muscle spindle was increased.②Compared with the immobilization group，the SOL fibers in the vibration group showed an evident shift toward a increased percentage of fibers typeⅠ，but an decreased percentage of typeⅡ.The change of expression of MHC in muscle spindle was unconspicuous.Conclusion：HFV was effective in antagonizing the transform of typeⅠtoward typeⅡand the increased expression of MHC in muscle spindle in immobilization rats.The change was the most evident in 200Hz HFV group.

high frequency sinusoidal vibration；myosin heavy chain；muscle spindle

G 804.2

A

1005-0000（2011）06-0482-03

2011-08-30；

2011-10-21；錄用日期：2011-10-25

國家自然科學基金項目（項目編號：30901583）；陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目（項目編號：2009KW-20）；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金資助項目（項目編號：xjj20100181）

石 磊（1974-），男，山東泰安人，博士，教授，研究方向為運動生理學。

1.西安交通大學體育部，陜西西安710049；2.西北大學外國語學院，陜西西安710069；3.西安交通大學醫(yī)學院生理學教研室，陜西西安710061。