花燭胚性懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存條件研究

王更亮,許傳營(yíng),王廣東

花燭 (AnthuriumandraeanumL ind.)又名紅掌、安祖花,為天南星科 (A raceae)花燭屬 (AnthuriumSchott)多年生常綠草本植物[1],因其花型獨(dú)特、花色艷麗、周年開花而備受人們喜愛,是具有較高觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的花卉之一?；T屬植物種類豐富(約 550余種),且經(jīng)過長(zhǎng)期的種間雜交已培育出大量栽培品種,截至 20世紀(jì) 90年代已培育出 100余個(gè)優(yōu)良的花燭栽培品種[2]。目前,花燭種質(zhì)資源的保存主要采用傳統(tǒng)的田間資源圃和組織培養(yǎng)保存法。傳統(tǒng)的種質(zhì)資源保存方法不僅需要大量的人力、物力及土地,還受到栽培環(huán)境的影響,在保存過程中易發(fā)生變異進(jìn)而導(dǎo)致花燭種性退化和丟失,最終影響優(yōu)良種質(zhì)資源的利用。因此,建立一種操作簡(jiǎn)便并能長(zhǎng)期穩(wěn)定保存花燭種質(zhì)資源的方法至關(guān)重要。

超低溫保存是植物種質(zhì)資源保存的有效方法之一。常規(guī)超低溫保存多采用兩步法,但需要程序降溫儀等專業(yè)設(shè)備,且保存效果不穩(wěn)定、存活率低,不同種類間的保存效果存在差異,在實(shí)際應(yīng)用過程中存在較多問題[3]。玻璃化超低溫保存技術(shù)則克服了上述缺點(diǎn),植物材料經(jīng)冷凍保護(hù)劑處理后可以直接于液氮中保存,無論是成本還是凍后存活率均有較大改進(jìn),是目前植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存最為有效而簡(jiǎn)便的方法,具有較廣的應(yīng)用前景[4]。目前采用玻璃化超低溫保存法已成功保存了荔枝 (LitchichinensisSonn.)[5]、枇杷〔Eriobotryajaponica(Thunb.)L ind l.〕[6]及長(zhǎng)鞭紅景天〔Rhodiolafastigiata(Hook.f.et Thom s.)S.H. Fu〕[7]等多種植物的懸浮細(xì)胞系。

在已獲得花燭胚性懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上,作者對(duì)花燭胚性懸浮細(xì)胞的玻璃化超低溫保存條件(包括繼代培養(yǎng)時(shí)間、滲透調(diào)節(jié)劑種類和濃度及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、裝載液種類和預(yù)處理時(shí)間、冷凍保護(hù)劑 PVS2脫水時(shí)間和超低溫保存后的化凍溫度)進(jìn)行了比較研究,篩選出適宜的保存條件,以期為花燭種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以花燭品種‘Am igo’葉片為外植體,采用辛偉杰等[8]的方法誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織；將胚性愈傷組織接種于 250 m L三角瓶中,參照文獻(xiàn)[9]的液體培養(yǎng)方法進(jìn)行增殖培養(yǎng)；用機(jī)械方法將增殖狀態(tài)良好的胚性愈傷組織細(xì)胞團(tuán)破碎成顆粒狀,網(wǎng)篩過濾,篩選出2mm的懸浮細(xì)胞團(tuán)作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)流程 選取繼代培養(yǎng) 3 d的直徑2mm的花燭胚性懸浮細(xì)胞團(tuán) (0.2 g),用 1/2M S液體培養(yǎng)基 (含 80 g·L-1蔗糖,pH 5.8)預(yù)培養(yǎng) 2 d后,置于 4℃冰箱中低溫處理 24 h；參照 Sakai等[10]的配方配制裝載液 PVS2,在室溫條件下用體積分?jǐn)?shù) 25％的 PVS2預(yù)處理 10m in,然后用預(yù)冷至 0℃的體積分?jǐn)?shù)100％的 PVS2在0℃條件下脫水 7.5m in,隨即投入液氮中冷凍保存；凍存 6 h后,將細(xì)胞團(tuán)置于 37℃水浴中化凍。

化凍后,迅速移除 PVS2,室溫條件下用 1/2M S液體培養(yǎng)基 (含 1.2mo l·L-1蔗糖,pH 5.8)將細(xì)胞洗滌 3次,每次 10m in,然后將細(xì)胞首先轉(zhuǎn)移到含80 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基 (pH 5.8)中,置于 25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 3 d后,轉(zhuǎn)到含 40 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基(pH 5.8)中繼續(xù)暗培養(yǎng) 2 d,最后轉(zhuǎn)移至正常液體繼代培養(yǎng)基(含 1.0m g·L-12, 4-D、0.5m g·L-1KT和 30 g·L-1蔗糖的 1/2M S培養(yǎng)基,pH 5.5)中振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為 100 r·m in-1,散射光,培養(yǎng)溫度 25℃～28℃?；謴?fù)培養(yǎng) 5 d后測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采取逐步優(yōu)化方法對(duì)影響超低溫保存效果的各種因素 (包括繼代培養(yǎng)時(shí)間、滲透調(diào)節(jié)劑的種類和濃度及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、裝載液種類及預(yù)處理時(shí)間、PVS2脫水時(shí)間和化凍溫度)進(jìn)行單因子實(shí)驗(yàn),除對(duì)待優(yōu)化因素進(jìn)行不同設(shè)置外,其他條件均與基本培養(yǎng)流程相同。

繼代培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置 5個(gè)處理：1、3、5、7和 9 d；預(yù)培養(yǎng)過程中的滲透調(diào)節(jié)劑分別為蔗糖和山梨醇,蔗糖質(zhì)量濃度設(shè)置 4個(gè)梯度：60、80、100和 120 g·L-1,山梨醇濃度設(shè)置 3個(gè)梯度：0.3、0.5和 0.7 mo l· L-1,二者均分別設(shè)置 5個(gè)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間：0、1、2、3和 4 d；預(yù)處理中使用的裝載液分別為體積分?jǐn)?shù) 25％、60％和 80％的 PVS2以及混合液 (包含 2mo l·L-1甘油和 0.4mo l·L-1蔗糖),處理時(shí)間分別設(shè)置為 0、5、10、15和20 m in；用體積分?jǐn)?shù)100％PVS2脫水的時(shí)間設(shè)置 7個(gè)處理：0、5、10、15、20、25和 30 m in；化凍溫度設(shè)置 6個(gè)處理：10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃。各處理的懸浮細(xì)胞團(tuán)用量均為 0. 2 g,各 3次重復(fù)。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定 采用氯化三苯四氮唑(TTC)法檢測(cè)恢復(fù)培養(yǎng) 5 d后花燭胚性懸浮細(xì)胞的細(xì)胞活力,用吸收值 (TTC值)表示超低溫保存后細(xì)胞的存活率[11-12],并據(jù)此計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率,計(jì)算公式為：細(xì)胞相對(duì)存活率 =(處理后細(xì)胞的 TTC值/未處理細(xì)胞的 TTC值)×100％。

2 結(jié)果和分析

2.1 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

對(duì)于玻璃化超低溫保存技術(shù)來說,保存材料的生理狀態(tài)與其抗寒性、耐干燥及脫水能力有關(guān),是影響玻璃化超低溫保存效果的重要因素之一。繼代培養(yǎng)時(shí)間不同的花燭懸浮細(xì)胞經(jīng)玻璃化超低溫保存后的相對(duì)存活率見表 1。由表 1可看出,繼代培養(yǎng) 1 d的花燭懸浮細(xì)胞經(jīng)冷凍保存后的相對(duì)存活率較低,僅為13.5％；繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞相對(duì)存活率也逐漸提高,細(xì)胞的抗凍能力有所增強(qiáng)。繼代培養(yǎng) 3 d的懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率最高,達(dá)到 20.4％；繼代培養(yǎng) 5 d的細(xì)胞相對(duì)存活率也較高,為 19.7％。繼代培養(yǎng)時(shí)間超過 5 d后,隨繼代培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng),懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率呈下降趨勢(shì),繼代培養(yǎng) 9 d的花燭懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率最低,僅為 8.7％,細(xì)胞的抗凍能力最差。造成這一現(xiàn)象的原因可能是培養(yǎng) 3～5 d的懸浮細(xì)胞正處于指數(shù)生長(zhǎng)期,處于此時(shí)期的細(xì)胞凍存后能保持分裂能力的細(xì)胞占有較高比例,并且大部分細(xì)胞體積較小、細(xì)胞質(zhì)較濃、細(xì)胞壁較薄、無液泡,比具有液泡或細(xì)胞壁較厚的懸浮細(xì)胞更耐凍。差異顯著性分析結(jié)果表明,經(jīng)冷凍保存后,繼代培養(yǎng)3和 5 d的懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率極顯著高于繼代培養(yǎng)1、7和 9 d的懸浮細(xì)胞(P＜0.01),因而,繼代培養(yǎng)3～5 d的花燭胚性懸浮細(xì)胞是玻璃化超低溫保存的理想材料。

表 1 不同繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響1)Tab le 1 Effect of d ifferen t subcu lture tim es on rela tive surv iva l ra te of em bryon ic suspen sion cells of An thu rium and raeanum L ind.after v itr ifica tion cryopreserva tion1)

2.2 滲透調(diào)節(jié)劑對(duì)懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

用含不同滲透調(diào)節(jié)劑 (蔗糖和山梨醇)的 1/2M S液體培養(yǎng)基對(duì)繼代培養(yǎng) 3 d的花燭胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)培養(yǎng),懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率見表2。結(jié)果表明,未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞活性極低,抗凍能力較弱,恢復(fù)培養(yǎng)后的生長(zhǎng)狀態(tài)較差,細(xì)胞相對(duì)存活率僅約 5％；而用含有不同質(zhì)量濃度蔗糖或山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞活性明顯增強(qiáng),細(xì)胞相對(duì)存活率顯著增加,但預(yù)培養(yǎng)超過一定時(shí)間后,相對(duì)存活率開始下降。總體來說,經(jīng)含有不同濃度蔗糖或山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng) 2 d,懸浮細(xì)胞的抗凍能力最強(qiáng),相對(duì)存活率最高。

2.2.1 蔗糖的影響效應(yīng) 由表 2可見,用含有不同質(zhì)量濃度蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基對(duì)花燭懸浮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),經(jīng)過玻璃化超低溫冷凍保存后花燭懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率有一定的波動(dòng)。用含 80 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率大幅度增加,用含 100 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的花燭懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率較高,而用含 120 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率則有所降低。

表 2 滲透調(diào)節(jié)劑和預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響Tab le 2 Effectsof osm otic regu la ting agen tsand pre-cu lture tim e on rela tive surv iva l ra te of An thu rium andraeanum L ind.em bryon ic suspen sion cellsafter v itr ifica tion cryopreserva tion

在蔗糖質(zhì)量濃度相同的條件下,延長(zhǎng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,各處理組懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率并不因預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,預(yù)培養(yǎng) 2或 3 d的懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率最高,超過適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,各處理組花燭懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率均下降。用含 60 g·L-1蔗糖的1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng) 3 d,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率最高；分別用含 80和 100 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng) 2 d,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率最高；而用含 120 g·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)1 d,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率即達(dá)到最大值。這可能是由于蔗糖質(zhì)量濃度的升高和培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均可導(dǎo)致細(xì)胞過度脫水,產(chǎn)生滲透脅迫,不利于花燭懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用含 100 g·L-1蔗糖的1/2M S液體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng) 2 d,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后,花燭胚性懸浮細(xì)胞恢復(fù)活力的效果較好。

2.2.2 山梨醇的影響效應(yīng) 由表 2還可看出,預(yù)培養(yǎng)基中添加的山梨醇濃度與預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)經(jīng)過玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率也有較大影響。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間相同,花燭懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率隨山梨醇濃度的提高表現(xiàn)出一定的波動(dòng)變化趨勢(shì),其中,用含 0.5 mo l·L-1山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率最高。

在山梨醇濃度相同的條件下,延長(zhǎng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,花燭懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率并不因預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,而是在適宜預(yù)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到最高,超過該時(shí)間則降低。經(jīng)過 2 d的預(yù)培養(yǎng),在玻璃化超低溫保存后花燭懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率均最高。

綜合分析后可看出,以山梨醇作為滲透調(diào)節(jié)劑對(duì)花燭懸浮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),經(jīng)玻璃化超低溫保存后懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率優(yōu)于以蔗糖作為滲透調(diào)節(jié)劑進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞,最高可達(dá) 26.2％。因而,在花燭懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存過程中,適宜的預(yù)培養(yǎng)基為含 0.5mol·L-1山梨醇的 1/2M S液體培養(yǎng)基,最佳預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d。

2.3 裝載液預(yù)處理對(duì)懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

用不同裝載液對(duì)花燭胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)處理,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率見圖 1。由圖 1可見,未經(jīng)裝載液預(yù)處理的懸浮細(xì)胞經(jīng)玻璃化超低溫保存后的相對(duì)存活率較低。而用裝載液預(yù)處理不同時(shí)間,經(jīng)玻璃化超低溫保存后懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率有一定的差異,基本變化趨勢(shì)是在一定時(shí)間內(nèi)預(yù)處理時(shí)間越長(zhǎng)懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率越高,但超過適宜預(yù)處理時(shí)間,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率則降低,這可能是由于預(yù)處理時(shí)間過長(zhǎng),裝載液則對(duì)懸浮細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用,致使懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率下降。

圖 1 裝載液種類及預(yù)處理時(shí)間對(duì)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響F ig.1 Effects of load ing solution types and pre-trea tm en t tim e on rela tive surv iva l ra te of A n thu rium and raeanum Lind.em bryon ic suspen sion cellsa fter v itr ifica tion cryop reserva tion

用不同裝載液對(duì)懸浮細(xì)胞進(jìn)行相同時(shí)間的預(yù)處理,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率有一定的差異,其中,用體積分?jǐn)?shù) 25％PVS2處理 15 m in,經(jīng)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率最高,達(dá)到29.0％。因此,用裝載液對(duì)花燭懸浮細(xì)胞預(yù)處理的最適條件為用體積分?jǐn)?shù) 25％PVS2室溫預(yù)處理 15m in。

2.4 脫水時(shí)間對(duì)懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

以體積分?jǐn)?shù) 100％PVS2為冷凍保護(hù)劑,對(duì)花燭胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的脫水處理,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率見圖 2。結(jié)果表明,未經(jīng)體積分?jǐn)?shù) 100％PVS2脫水處理的懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率較低,僅為 7.7％；用體積分?jǐn)?shù) 100％PVS2處理 10 m in的胚性懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率最高,達(dá)到32.1％；處理時(shí)間超過 10 m in,懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樘幚頃r(shí)間低于 10m in,細(xì)胞脫水不充分,在降溫過程中不能迅速達(dá)到玻璃化狀態(tài),因而不易成活；而處理時(shí)間超過 10m in,細(xì)胞受到 PVS2的毒害作用,相對(duì)存活率也有所下降。

圖2 體積分?jǐn)?shù)100％PVS2處理不同時(shí)間對(duì)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響F ig.2 Effect of d ifferen t trea tm en t tim es of 100％PVS2 on rela tive surv iva l ra te of A n thu rium and raeanum L ind.em bryon ic suspen sion cellsafter v itr ifica tion cryopreserva tion

2.5 化凍溫度對(duì)懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響

經(jīng)過玻璃化超低溫保存后再用不同溫度水浴化凍,花燭胚性懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率見圖 3。結(jié)果表明,化凍溫度低,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率也較低；化凍溫度為 40℃,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率最高,達(dá)到32.1％；化凍溫度超過 40℃,懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率則逐漸下降。造成這一現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)榛瘍鰷囟冗^低時(shí)細(xì)胞易發(fā)生次生結(jié)冰現(xiàn)象,致使細(xì)胞受到傷害；而化凍溫度過高又易使懸浮細(xì)胞受到化學(xué)毒害。所以,經(jīng)過玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞水浴化凍的最適溫度為 40℃。

圖 3 化凍溫度對(duì)玻璃化超低溫保存后花燭胚性懸浮細(xì)胞相對(duì)存活率的影響F ig.3 Effect of thaw ing tem pera ture on rela tive surv iva l ra te of A n thu rium and raeanum Lind.em bryonicsuspen sioncells a fter v itr ifica tion cryopreserva tion

3 討論和結(jié)論

通過上述實(shí)驗(yàn),對(duì)花燭胚性懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存過程中各步驟的適宜條件進(jìn)行了比較分析,初步建立的適宜于花燭品種‘Am igo’胚性懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存和化凍流程為：將繼代培養(yǎng) 3～5 d、直徑 2mm的懸浮細(xì)胞團(tuán)在含 0.5mo l·L-1山梨醇的1/2M S液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng) 2 d后,置于 4℃條件下處理 24 h,然后用體積分?jǐn)?shù) 25％PVS2預(yù)處理15m in,再于 0℃條件下用體積分?jǐn)?shù) 100％PVS2脫水10m in,迅速投入液氮中凍存；凍存后的懸浮細(xì)胞在40℃水浴中化凍 3m in,然后用含 1.2mo l·L-1蔗糖的 1/2M S液體培養(yǎng)基洗滌 3次,每次 10m in,洗滌后的懸浮細(xì)胞即可轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞的生理狀態(tài)、預(yù)培養(yǎng)、預(yù)處理和脫水處理是決定花燭胚性懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存能否成功的重要因素。其中,預(yù)培養(yǎng)可以減少細(xì)胞內(nèi)的自由水含量,提高細(xì)胞的束縛水含量,增強(qiáng)細(xì)胞抗凍性。此外,用適宜濃度的山梨醇進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),其效果優(yōu)于蔗糖,這可能與“在液體培養(yǎng)基中添加山梨醇可以極大地降低冰晶的形成溫度和形成速率”[13]有關(guān)。

花燭懸浮細(xì)胞的含水量較大,預(yù)培養(yǎng)后仍需經(jīng)過脫水處理以降低細(xì)胞內(nèi)的含水量,而用高濃度冷凍保護(hù)劑直接進(jìn)行脫水容易對(duì)細(xì)胞造成物理和化學(xué)毒害,因此,如何減少高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的傷害是玻璃化超低溫保存成功與否的關(guān)鍵[14]。研究結(jié)果表明,在用冷凍保護(hù)劑脫水前采用低濃度保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理,可以獲得較好的效果?？赡艿脑蚴窃诩彼倜撍坝美鋬霰Ｗo(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理具有一定的緩沖效果,減輕了劇烈脫水對(duì)細(xì)胞的傷害,保持了細(xì)胞膜的完整性[15-16]；預(yù)處理后的懸浮細(xì)胞再經(jīng)脫水處理,可以進(jìn)一步降低細(xì)胞含水量,促進(jìn)低溫時(shí)玻璃化狀態(tài)的形成,從而減少冰晶形成過程中對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害[17]。但關(guān)于預(yù)處理的作用機(jī)制目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

一般來說,保存材料在高濃度糖中長(zhǎng)期培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生高滲傷害,懸浮細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間浸于玻璃化溶液中也會(huì)造成脫水過度,因此保存材料的耐脅迫性及適宜的處理時(shí)間對(duì)植物懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存至關(guān)重要[18]。而保存材料對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力與植物的基因型以及不同階段的生理狀態(tài)等因素有關(guān)[17],尤其是對(duì)不耐寒的熱帶和亞熱帶植物進(jìn)行玻璃化超低溫保存時(shí),更應(yīng)選擇生理狀態(tài)最佳的材料。

超低溫保存過程中,保存材料在液氮中保存時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)保存效果影響較小,例如：保存 1 d和保存10個(gè)月的櫻桃〔Cerasuspseudocerasus(L ind l.)G. Don〕在保存效果上無明顯區(qū)別[19]。目前,多采用35℃～40℃水浴對(duì)超低溫保存材料進(jìn)行化凍,花燭胚性懸浮細(xì)胞玻璃化超低溫保存后需要經(jīng)過 40℃水浴快速化凍才能保持較高的相對(duì)存活率,但木本植物的冬芽超低溫保存后必須在 0℃低溫下慢速化凍才能達(dá)到最好的效果[20]?？梢?冷凍保存的植物種類不同,其化凍溫度也不同。

值得注意的是,恢復(fù)生長(zhǎng)后花燭胚性懸浮細(xì)胞的實(shí)際再生率低于用 TTC法檢測(cè)的懸浮細(xì)胞的相對(duì)存活率。一方面可能是由于 TTC法檢測(cè)是以脫氫酶的活力為標(biāo)準(zhǔn),不能完全反映保存材料經(jīng)超低溫處理后的損傷程度；另一方面也可能是在超低溫保存后細(xì)胞未達(dá)到恢復(fù)生長(zhǎng)的要求。此外,超低溫保存后保存材料的再生能力也可能與植物本身的抗寒性有關(guān),因此,不同品種花燭胚性懸浮細(xì)胞的適宜保存條件有一定的差異,應(yīng)分別進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

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