耐鈾顆粒污泥微生物群落結(jié)構(gòu)解析

曾濤濤，魯慧珍，劉迎九，劉金香，榮麗杉，馬華龍，謝水波， 3

（1. 南華大學(xué) 礦業(yè)工程博士后流動(dòng)站，衡陽(yáng) 421001；2. 南華大學(xué) 污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng) 421001；3. 南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng) 421001）

耐鈾顆粒污泥微生物群落結(jié)構(gòu)解析

曾濤濤1， 2，魯慧珍2，劉迎九2，劉金香2，榮麗杉2，馬華龍2，謝水波2， 3

（1. 南華大學(xué) 礦業(yè)工程博士后流動(dòng)站，衡陽(yáng) 421001；
2. 南華大學(xué) 污染控制與資源化技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng) 421001；
3. 南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng) 421001）

以厭氧顆粒污泥為對(duì)象，測(cè)試其對(duì)不同濃度U（Ⅵ）（2.4～12 mg/L）的去除效果，通過環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）和高通量測(cè)序技術(shù)等方法解析鈾脅迫下微生物群落結(jié)構(gòu)特性。結(jié)果表明：在初始U（Ⅵ）濃度為9.6mg/L、pH為6、投加濕污泥2g（污泥的可揮發(fā)性懸浮在體濃度為0.1g）條件下，U（Ⅵ）的去除率最高，達(dá)到95.1%；顆粒污泥中微生物以直徑約1 μm的球形細(xì)菌為主，能譜分析（EDS）也證明細(xì)胞表面鈾的存在。高通量測(cè)序得到15939條有效序列，可劃分操作分類單元939個(gè)。樣品文庫(kù)覆蓋率為0.967，Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)分別為4.099、3140.55與2122.53，表明樣品具有較高的微生物多樣性與豐富度。菌屬分類顯示：顆粒污泥中包含許多典型的鈾還原固定菌屬，如Acinetobacter、Clostridium、Pseudomonas、Sulfurovum、Sulfurospirillum及Trichococcus，這是顆粒污泥具有高效除鈾效果與耐鈾性能的原因。

耐鈾性能；顆粒污泥；微生物群落；高通量測(cè)序

隨著我國(guó)鈾礦冶的發(fā)展，產(chǎn)生了大量含鈾廢水，其中鈾濃度一般為1～5 mg/L，有些地方甚至更高，達(dá)到10 mg/L，對(duì)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在自然界中，鈾主要以難溶態(tài)四價(jià)鈾（U（Ⅳ））和溶解態(tài)六價(jià)鈾（U（Ⅵ））兩種形態(tài)存在，溶解態(tài) U（Ⅵ）極易隨水流遷移，引起鈾污染擴(kuò)散［1］。因此，水體除鈾通常指去除溶液中的六價(jià)鈾及其化合物，避免其通過重金屬化學(xué)毒性和放射性輻射兩種方式對(duì)人體健康產(chǎn)生危害［2］。

與物理和化學(xué)處理方法相比，利用微生物進(jìn)行含鈾廢水處理，具有低耗、價(jià)廉、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)［3］。在實(shí)際鈾污染場(chǎng)地，通常存在一些耐鈾微生物，如假單胞菌（Pseudomonas sp.）、硫酸鹽還原菌（SRB）、地桿菌（Geobacter spp.）、希瓦氏菌（Shewanella spp.）、梭菌（Clostridium spp.）、嗜酸細(xì)菌（Acidotolerant）等［4］，這些微生物通過生物吸附及還原作用，將鈾進(jìn)行沉淀、固定，降低其對(duì)環(huán)境的危害。顆粒污泥因其獨(dú)特的層狀結(jié)構(gòu)，成為多種微生物棲身的理想場(chǎng)所，成為常規(guī)污水生物處理研究的熱點(diǎn)［5］。目前，一些研究者嘗試?yán)妙w粒污泥進(jìn)行含鈾廢水處理。TAPIA-RODRIGUEZ等［6］研究了不同電子供體對(duì)顆粒污泥除鈾的影響，并探討除鈾機(jī)理，結(jié)果表明：顆粒污泥主要通過還原、沉淀作用去除廢水中的 U（Ⅵ），在無外加電子供體情況下，也具有很好的除鈾效果。本文作者前期研究中發(fā)現(xiàn)，以粉末厭氧顆粒污泥為吸附劑，在pH=6.0、溫度30 ℃時(shí)，對(duì)初始濃度為10 mg/L的U（Ⅵ）去除率達(dá)到93.72%［7］。研究發(fā)現(xiàn)［8］，利用SRB顆粒污泥處理含U（Ⅳ）廢水，鈾在顆粒污泥上主要以穩(wěn)定 U（Ⅵ）形式沉積。

這些研究表明，顆粒污泥在鈾廢水生物處理中具有良好的應(yīng)用潛力，但目前尚缺乏對(duì)除鈾顆粒污泥中微生物菌屬及群落結(jié)構(gòu)特性的深入分析。本文作者利用厭氧顆粒污泥對(duì)低濃度含鈾廢水進(jìn)行處理，并通過環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）觀察顆粒污泥微觀結(jié)構(gòu)，通過高通量測(cè)序技術(shù)，全方位、超深度解析鈾脅迫下顆粒污泥微生物菌屬多樣性及群落結(jié)構(gòu)特征，為耐鈾顆粒污泥在含鈾廢水處理的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 污泥來源及理化性質(zhì)分析

實(shí)驗(yàn)用顆粒污泥取自湖南某檸檬酸廠的厭氧內(nèi)循環(huán)（IC）反應(yīng)器中，顆粒污泥取樣后，立即置于冰箱-20℃厭氧保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行試驗(yàn)前，顆粒污泥用去離子水淘洗過篩。通過數(shù)碼相機(jī)，拍攝顆粒污泥外觀（見圖 1（a））。用總懸浮固體（TSS）來表示顆粒污泥固體含量 w（TSS），用可揮發(fā)性懸浮固體（VSS）來衡量顆粒污泥中活性微生物量的含量（w（VSS）），w（TSS）、w（VSS）通過灼燒法測(cè)定。

1.2 U（Ⅵ）去除試驗(yàn)

稱取一定量U3O8（分析純），按GBW04201方法配制標(biāo)準(zhǔn)鈾溶液（20 mg/L）。U（Ⅵ）去除試驗(yàn)裝置如圖1（b）所示，血清瓶上部為微氧條件（0.5～1 mg/L）。取鈾標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用去離子水稀釋成2.4、4.8、7.2、9.6、12 mg/L并調(diào)節(jié)pH=6.0，加入淘洗后的顆粒污泥2 g，通過搖床振蕩培養(yǎng)。U（Ⅵ）濃度采用5Br-PADAP分光光度法測(cè)定［9］。

1.3 顆粒污泥微觀結(jié)構(gòu)觀察

取 0.5 g反應(yīng)后的顆粒污泥樣品，通過 10000 r/min、4 ℃離心10 min，去除上清液。置于-80 ℃冰箱（SANYO，MDF-U32V）冷凍24 h，通過真空冷凍干燥機(jī)（Freeze Dryer，F(xiàn)D5-series）對(duì)樣品真空干燥24 h。之后將樣品噴金，通過FEI QUANTA 200 環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）觀察顆粒污泥微觀結(jié)構(gòu)，并取典型細(xì)胞表面，利用EDAX Genesis 2000 X射線能譜儀 （EDS）分析細(xì)胞表面元素組成。

圖1 顆粒污泥及U（Ⅵ）去除試驗(yàn)裝置示意圖Fig. 1 Morphology of granular sludge （a） and schematic diagram of U （Ⅵ） removal test equipment （b）

1.4 高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

1.4.1 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

取 0.5 g顆粒污泥，按照 OME GA 公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒操作步驟，抽提顆粒污泥基因組DNA，利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。

采用融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物341F（CCTACACGACGCTCTTCCGA TCTN（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG）與805R（GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGA GAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC），對(duì)細(xì)菌16S rDNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系包括：5 μL 10×Buffer，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，0.5 μL 50 uM前引物，0.5 μL 50 umol/L后引物，10 ng DNA 模板以及 0.5 μL Plantium Taq Polymerase （5 U/uL，Thermo）。

PCR擴(kuò)增程序如下：先在95 ℃反應(yīng)3 min，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)，每一次擴(kuò)增循環(huán)分別在95 ℃、55 ℃和72 ℃溫度下保持30 s，共循環(huán)25次，最后在72 ℃保持5 min，最后在10 ℃條件下5 min退火結(jié)束反應(yīng)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，將同一樣品混合后用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用上海生工公司生產(chǎn)的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（cat：SK8131）切膠回收PCR產(chǎn)物。

1.4.2 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，通過Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)所得序列進(jìn)行質(zhì)控，去除引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列及低質(zhì)量序列。將多條序列根據(jù)相互之間的距離進(jìn)行聚類，根據(jù)序列之間的相似性作為域值（0.97）劃分操作分類單元（OTU）。

采用 Mothur軟件（http：//www.mothur.org/）分析Alpha多樣性指數(shù)，包括豐富度指數(shù)（Richness）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等。豐富度指數(shù)用于衡量單個(gè)樣本中物種種類個(gè)數(shù)，實(shí)際通過操作分類單元的個(gè)數(shù)來計(jì)算。香農(nóng)指數(shù)（H）衡量群落的異質(zhì)性，公式H=-∑PilnPi來計(jì)算（其中Pi為各種群物種數(shù)與樣本總物種比值；用ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)估計(jì)群落中含OTU 數(shù)目，結(jié)果可反映物種多樣性）。計(jì)算樣品文庫(kù)的覆蓋率（Coverage，C），計(jì)算公式為C=1-N1/N（其中：N1為只含有一條序列的 OTU 的數(shù)目；N為抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目）［10］。采用 RDP classifier將序列進(jìn)行物種分類，以菌屬（Genus）為分類單位，進(jìn)行序列與物種豐度計(jì)算，繪制菌屬豐度柱狀圖。

2 結(jié)果分析

2.1 顆粒污泥性質(zhì)

數(shù)碼照相發(fā)現(xiàn)，顆粒污泥為深黑球狀，粒徑約為0.5～3 mm（見圖1（a））。顆粒污泥的w（TSS）、w（VSS）與w（VSS）/w（TSS）值測(cè)定結(jié)果如表 1所列。其中，w（VSS）/w（TSS）可用來衡量微生物在顆粒污泥中所占的比例，w（VSS）/w（TSS）值越大，微生物所占比例就越高。由表1可知，顆粒污泥的w（VSS）為5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）濕污泥，w（VSS）/w（TSS）為0.611，微生物所占比例較高。顆粒污泥獨(dú)特的層狀結(jié)構(gòu)，是多種厭氧微生物理想的棲身場(chǎng)所，而許多厭氧微生物對(duì)U（Ⅵ）具有吸附和還原作用，因此，以顆粒污泥進(jìn)行U（Ⅵ）去除效果分析。

表1 重量法測(cè)污泥濃度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of sludge concentration by weight test

2.2 U（）Ⅵ 的去除效果

地浸與堆浸滲出廢水中鈾的濃度一般在 5 mg/L以下，在余酸較多或存在凸鏡體時(shí)，坑道滲出液中鈾的濃度可能會(huì)升高至10 mg/L以上。配置U（Ⅵ）初始濃度時(shí)，設(shè)置2.4～12 mg/L的梯度溶液，溫度為室溫條件（25 ℃），并調(diào)節(jié)pH為6.0，投加濕污泥2 g（對(duì)應(yīng)VSS為0.1），反應(yīng)24 h后，測(cè)定血清瓶剩余U（Ⅵ）濃度，計(jì)算U（Ⅵ）的去除率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 U（Ⅵ）的去除效果Fig. 2 Removal rate of U（Ⅵ）

由圖2可見，顆粒污泥對(duì)不同濃度的U（Ⅵ）溶液去除效果不同，在低濃度U（Ⅵ）溶液中（2.4 mg/L），去除率為73.6%。隨著U（Ⅵ）濃度升高，去除率也逐漸提高，初始U（Ⅵ）濃度為9.6 mg/L時(shí)，去除率最高，達(dá)到95.1%。在初始U（Ⅵ）濃度為12 mg/L情況下，去除效果略有下降（94.7%）。反應(yīng)24 h之后，5個(gè)樣品剩余U（Ⅵ）濃度在0.47～0.92 mg/L之間，大部分U（Ⅵ）被去除，顯示顆粒污泥中微生物具有良好的耐鈾能力。在初始U（Ⅵ）濃度為9.6 mg/L情況下，U（Ⅵ）去除率最高，剩余U（Ⅵ）濃度最低（0.47 mg/L），能較好地反映顆粒污泥去除鈾的特性，選取此條件下的顆粒污泥進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察與微生物群落結(jié)構(gòu)解析。

2.3 微生物形態(tài)特征

顆粒污泥真空干燥之后，樣品壓平、噴金30 s，在20 kV加速電壓下的形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖3所示。并從細(xì)胞表面取點(diǎn)進(jìn)行能譜分析，其能譜圖和各元素的組成如圖4和表2所示。

由圖3可知，顆粒污泥微生物形態(tài)為球形，直徑接近1 μm。許多球形菌聚集在一起，形成團(tuán)聚結(jié)構(gòu)，這有助于微生物在缺氧環(huán)境生長(zhǎng)及相互間的物質(zhì)、能量傳遞。在此之前進(jìn)行了不加鈾處理的顆粒污泥環(huán)境掃描電鏡及能譜分析，空白組顆粒污泥細(xì)胞聚集緊密，EDS顯示沒有U元素存在。而經(jīng)過9.6 mg/L鈾處理，顆粒污泥細(xì)胞表面光滑、形態(tài)均稱、生長(zhǎng)良好，表明厭氧顆粒污泥能夠耐受較高U（Ⅵ） 濃度，推測(cè)其中微生物具有較強(qiáng)的鈾還原、固定效果。與普通活性污泥相比，顆粒污泥對(duì)廢水中重金屬毒性抵抗能力大大增強(qiáng)，TYUPA等［11］研究銀與鈾對(duì)活性污泥的毒害作用，發(fā)現(xiàn)顆粒污泥對(duì)重金屬毒害作用的抗性能夠提高50%。通過能譜分析顆粒污泥中元素組成及比例，結(jié)果表明：C、O、P、S、Ca、Fe 6種元素的特征峰最明顯，所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和達(dá)到95.97%。由于U的原子序數(shù)大，不容易激發(fā)，特征峰不明顯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.59%。

圖3 顆粒污泥的微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Microorganisms morphologies of sludge particles

圖4 顆粒污泥微生物元素EDS譜Fig. 4 EDS results of elemental composition in granular sludge

表2 圖4中各元素的組成及含量Table 2 Composition and content of elements in Fig. 4

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)解析

2.4.1 樣本序列

對(duì)測(cè)序的原始序列（17683條）進(jìn)行質(zhì)控，包括去除Barcode、兩端Primer、以及部分低質(zhì)量序列，去除嵌合體及靶區(qū)域外序列。質(zhì)控后樣本可用于分析的序列數(shù)量為15939，長(zhǎng)度大部分在400～500之間，平均長(zhǎng)度為416（見表3），滿足序列分析要求。

表3 微生物序列分析結(jié)果Table 3 Microbial community sequencing results of anaerobic granular sludge

2.4.2 微生物多樣性分析

將多條序列按其序列間的距離對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值（0.97）分成操作分類單元（OTU）。計(jì)算Alpha多樣性指標(biāo)，包括豐富度指數(shù)（Richness）、香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)等、覆蓋率（Coverage）等，其結(jié)果如表4所示。樣本中隨機(jī)抽取序列數(shù)為橫坐標(biāo)，分別以相應(yīng)的OTU數(shù)目、香農(nóng)指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制出豐富度稀疏分析圖、香農(nóng)指數(shù)圖、ACE指數(shù)圖與Chao1指數(shù)圖，結(jié)果如圖5所示。

表4 顆粒污泥微生物Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)表Table 4 Alpha index of microbial diversity in granular sludge

圖5 物種多樣性分析圖Fig. 5 Results of microbial diversity： （a） Richness rarefaction chart； （b） Shannon rarefaction chart； （c） ACE rarefaction； （d） Chao1 rarefaction

本試驗(yàn)中樣本覆蓋率數(shù)值達(dá)到0.967，非常接近1，反映樣本中序列沒有被測(cè)出的概率極低，能很好地代表樣本真實(shí)情況。15939條序列可分成939個(gè)OUT，每個(gè)操作分類單元被類似為一個(gè)微生物菌種，表明顆粒污泥中微生物種類很多。圖 5（a）所示的豐富度稀疏曲線最終趨向平坦，說明取樣的數(shù)量合理，能很好地反映取樣深度。

由表4可知，Shannon指數(shù)值為4.099，ACE指數(shù)達(dá)到3140.55，Chao1指數(shù)為2122.53，對(duì)應(yīng)圖5（b）～（d）3種曲線，序列數(shù)量達(dá)到或接近飽和，表明本研究所得的菌屬信息能全面地反映微生物多樣性。由此說明，在9.6 mg/L初始U（Ⅵ）濃度下，顆粒污泥微生物仍然表現(xiàn)出很高的菌屬多樣性，即顆粒污泥含有較多的耐鈾菌種。

2.4.3 微生物群落結(jié)構(gòu)解析

選擇 OTU操作單元里的代表序列（默認(rèn)豐度最高），采用軟件 RDP classifier進(jìn)行物種分類，分析genus（屬）水平對(duì)應(yīng)序列數(shù)量及其比例，對(duì)于所占比例小于 1%的物種統(tǒng)一用“Other”表示，根據(jù)菌屬類別及其比例，繪制物種豐度柱狀圖，其結(jié)果如圖6所示。從圖6可知，顆粒污泥中包含許多典型的耐鈾菌屬，它們具有較強(qiáng)的鈾還原、固定作用。如Acinetobacter、Clostridium、Pseudomonas、Sulfurovum、Sulfurospirillum 及 Trichococcus。Acinetobacter（不動(dòng)桿菌）所占比例為17.81%，包含序列 2838條，為顆粒污泥中第二大微生物菌屬。Acinetobacter為污水處理中常見微生物菌屬，ISLAM等［12］通過傳統(tǒng)培養(yǎng)及不依賴培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)研究了鈾礦細(xì)菌群落特性，發(fā)現(xiàn)兩種分析方法均顯示Acinetobacter為其中優(yōu)勢(shì)菌屬，具有抵抗鈾及其他重金屬毒性的能力。Clostridium（梭菌屬）所占比例為7.2%，包含序列1148條，是顆粒污泥固鈾的主要菌屬。Clostridium屬于厚壁菌門（Firmicutes），是鐵還原菌中的一種，具有還原沉淀鈾的能力。ZHANG等［13］研究離子液體對(duì) Clostridium sp.的生長(zhǎng)及吸附鈾的影響，發(fā)現(xiàn)離子液體會(huì)對(duì)Clostridium sp.的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，從而降低其對(duì)鈾的去除效果。

Pseudomonas（假單胞菌）所占比例為2.85%，包含序列454條，是顆粒污泥耐鈾的主要菌種之一。許多研究發(fā)現(xiàn) Pseudomonas對(duì)鈾具有很高的吸附固定效果，CHOUDHARY等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在pH為4的酸性條件下，假單胞菌種Pseudomonas aeruginosa對(duì)鈾的吸附容量達(dá)275 mg/g（干細(xì)胞），該菌種可以通過生物礦化作用去除99%的溶解性鈾，并能保持良好的生物活性，顯示其超強(qiáng)固鈾除鈾性能。

顆粒污泥中含有兩種典型硫酸鹽還原菌，即Sulfurovum（2.7% ， 包 含 序 列430條 ）與Sulfurospirillum（1.11%，包含序列177條）。Sulfurovum具有自養(yǎng)脫硫反硝化功能，HANDLEY等［15］進(jìn)行了鈾污染生物修復(fù)中的微生物群落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)Sulfurovum與其他硫酸鹽還原菌豐度較高。Sulfurospirillum屬于微氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，其廣泛存在于活性污泥、沉積物、地下水及微生物電化學(xué)合成系統(tǒng)中，目前，已有個(gè)別菌種完成了全基因組測(cè)序［16］。推測(cè)在本試驗(yàn)中，Sulfurovum 與Sulfurospirillum通過將硫酸根離子還原，間接完成U（Ⅵ）的還原與固定。Trichococcus（明串珠菌屬）所占比例為2.1%，包含序列334條。李于于［17］進(jìn)行砂巖型鈾礦中鐵素氧化還原相關(guān)細(xì)菌類群分析，發(fā)現(xiàn)此類細(xì)菌的存在，證明其與鐵的氧化還原相關(guān)，且能夠適應(yīng)鈾存在環(huán)境。

除了典型鈾還原固定菌屬之外，顆粒污泥還存在較多其他微生物菌屬。排在首位的是Petrimonas（理研菌屬），相對(duì)比例達(dá)到19.33%，包含序列數(shù)量3081條。Petrimonas具有厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫能力，SUN等［18］進(jìn)行活性污泥微生物燃料電池群落結(jié)構(gòu)解析時(shí)發(fā)現(xiàn)，Petrimonas與產(chǎn)甲烷菌是其中優(yōu)勢(shì)微生物，負(fù)責(zé)產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷過程。Levilinea（11.96%）和 Longilinea（1.77%）均屬于綠彎菌門的厭氧繩菌綱（Anaerolineae），曹新塏等［19］通過厭氧活性污泥對(duì)工業(yè)廢水中的萘進(jìn)行生物處理，發(fā)現(xiàn)微生物群落中 Levilinea的存在；王學(xué)華等［20］研究處理印染廢水的高效水解酸化UASB反應(yīng)器內(nèi)活性污泥菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) Levilinea、長(zhǎng)繩菌屬（Longilinea）是其中優(yōu)勢(shì)菌屬。這些研究結(jié)果表明：Levilinea與長(zhǎng)繩菌屬（Longilinea）具有適應(yīng)工業(yè)廢水復(fù)雜環(huán)境的能力。

Paludibacter和 Parabacteroides菌屬所占比例分別為4.25%與4.19%，均屬于擬桿菌門。擬桿菌是專性厭氧微生物，研究資料表明，擬桿菌屬在纖維素降解過程中發(fā)揮著重要的作用［21］，能發(fā)酵多種單糖和二糖產(chǎn)丙酸、乙酸和少量丁酸，有些菌種還有厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫作用。Erysipelotrichaceae所占比例為2.43%，研究發(fā)現(xiàn)此菌種與乳酸代謝相關(guān)［22］，由于顆粒污泥取自檸檬酸廢水處理厭氧反應(yīng)器中，該類菌種可能負(fù)責(zé)將中間產(chǎn)物進(jìn)行代謝。Proteocatella屬于專性厭氧菌，在本試驗(yàn)中所占比例為1.98%。黃龍［23］研究堿和接種物對(duì)剩余污泥厭氧酸化及其微生物群落多樣性的作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)Proteocatella存在厭氧顆粒污泥中，不能適應(yīng)pH為9的堿性環(huán)境。Syntrophomonas（互營(yíng)單胞菌）可以降解丁酸，是厭氧發(fā)酵中常見的微生物，在顆粒中所占比例為1.34%。周軒宇［24］進(jìn)行了新型厭氧反應(yīng)器處理造紙廢水效能及功能菌群落分析，發(fā)現(xiàn)Syntrophomonas為其中優(yōu)勢(shì)菌群，所占比例最高時(shí)達(dá)到（20.76%±0.51%），對(duì)造紙廢水容積負(fù)荷波動(dòng)表現(xiàn)出良好的抗沖擊性。

由于顆粒污泥中含有許多未明確分類細(xì)菌（Unclassified bacteria），所占比例7.85%，包含序列1252條。Unclassified bacteria的序列與已有菌屬相似性低，單獨(dú)例為一類，是顆粒污泥群落結(jié)構(gòu)的重要組成部分。另外，將所有比例低于1%的菌屬統(tǒng)一用other表示，這些菌屬之和所占比例為9.6%，序列之和為1540條。表示顆粒污泥中還含有大量的各類微生物菌屬，它們不屬于優(yōu)勢(shì)菌群，但與Unclassified bacteria一樣，它們對(duì)顆粒污泥群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及耐鈾性能起到重要作用。另外，對(duì)不同濃度鈾濃度脅迫下微生物群落結(jié)構(gòu)特性，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入分析。

圖6 Genus水平上物種豐度圖Fig. 6 Abundance of microbial species in genus level

3 結(jié)論

1） U（VI）濃度在2.4～9.6 mg/L，隨著U（VI）濃度增加，顆粒污泥去除 U（Ⅵ）的速率加快。在初始 U（Ⅵ）濃度為9.6 mg/L、pH為6、投加濕污泥2 g（w（VSS）= 0.1 g）的條件下，U（Ⅵ）的去除率最高，達(dá)到 95.1%，剩余U（Ⅵ）濃度最低，為0.47 mg/L。

2） 環(huán)境掃描電鏡（ESEM）結(jié)果顯示：顆粒污泥中微生物以直徑約1 μm的球形細(xì)菌為主，細(xì)胞表面光滑、形態(tài)均稱、生長(zhǎng)良好，相互形成團(tuán)聚結(jié)構(gòu)。能譜分析（EDS）也證明了細(xì)胞表面鈾的存在。

3） 高通量測(cè)序得到15939條有效序列，可劃分操作分類單元939個(gè)。樣品文庫(kù)覆蓋率為0.967，Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)分別為4.099、3140.55 與2122.53，反映顆粒污泥中微生物多樣性與豐富度均較高。菌屬分類顯示，顆粒污泥中包含許多典型的鈾還原固定菌屬，如 Acinetobacter、Clostridium、Pseudomonas、 Sulfurovum 、 Sulfurospirillum及Trichococcus，這是顆粒污泥具有高效除鈾效果與耐鈾性能的原因。

REFERENCES

［1］吳唯民， CARLEY J， WATSON D， 等. 地下水鈾污染的原位微生物還原與固定： 在美國(guó)能源部田納西橡樹嶺放射物污染現(xiàn)場(chǎng)的試驗(yàn)［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 31（3）： 449-459. WU Wei-min， CARLEY J， WATSON D， et al. Bioreduction and immobilization of uranium in situ： A case study at a USA Department of Energy radioactive waste site， Oak Ridge，Tennessee［J］. Acta Scientiae Circumstantiae， 2011， 31（03）：449-459.

［2］彭國(guó)文， 丁德馨， 胡 南， 楊雨山， 王曉亮. 納米 Fe3O4負(fù)載啤酒酵母菌對(duì)鈾的吸附性能與機(jī)理［J］. 中國(guó)有色金屬學(xué)報(bào)，2012， 22（2）： 604-610. PENG Guo-wen， DING De-xin， HU Nan， YANG Yu-shan，WANG Xiao-liang. Adsorption properties and mechanism of saccharomyces cerevisiae loaded by nano-Fe3O4on uranium［J］. The Chinese Journal of Nonferrous Metals， 2012， 22（2）：604-610.

［3］WILLIAMS K H， BARGAR J R， LLOYD J R， LOVLEY D R. Bioremediation of uranium-contaminated groundwater： A systems approach to subsurface biogeochemistry［J］. Curr Opin Biotechnol， 2013， 24（3）： 489-497.

［4］KENAROVA A， RADEVA G， TRAYKOV I， BOTEVA S. Community level physiological profiles of bacterial communities inhabiting uranium mining impacted sites［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2014， 100（2）： 226-232.

［5］GAO D， LIU L， LIANG H， WU W M. Aerobic granular sludge：Characterization， mechanism of granulation and application to wastewater treatment［J］. Crit Rev Biotechnol， 2011， 31（2）：137-152.

［6］TAPIA-RODRIGUEZ A， LUNA-VELASCO A， FIELD J A，SIERRA-ALVAREZ R. Anaerobic bioremediation of hexavalent uranium in groundwater by reductive precipitation with methanogenic granular sludge［J］. Water Research， 2010， 44（7）：2153-2162.

［7］陳華柏， 謝水波， 劉金香， 肖拾紅， 曾濤濤， 凌 輝， 王勁松.厭氧顆粒污泥吸附鈾（Ⅵ）的特性與機(jī)理［J］. 中國(guó)有色金屬學(xué)報(bào)， 2014， 24（9）： 2418-2425. CHEN Hua-bai， XIE Shui-bo， LIU Jin-xiang， XIAO Shi-hong，ZENG Tao-tao， LING Hui， WANG Jin-song. Characteristics and mechanism of uranium（Ⅵ） absorbed by anaerobic granular sludge［J］. The Chinese Journal of Nonferrous Metals， 2014，24（9）： 2418-2425.

［8］謝水波， 陳 勝， 馬華龍， 唐振平， 曾濤濤， 凌 輝， 吳宇琦.硫酸鹽還原菌顆粒污泥去除 U（VI）的影響因素及穩(wěn)定性［J］.中國(guó)有色金屬學(xué)報(bào)， 2015， 25（6）： 1713-1720. XIE Shui-bo， CHEN Sheng， MA Hua-long， TANG Zhen-ping，ZENG Tao-tao， LING Hui， WU Yu-qi. Influence factors and stability of U（VI） removal by sulfate reducing bacteria granular sludge［J］. The Chinese Journal of Nonferrous Metals， 2015，25（6）： 1713-1720.

［9］謝水波， 馬華龍， 唐振平， 凌 輝， 曾濤濤， 陳 勝， 王勁松.微氧條件下硫酸鹽還原菌顆粒污泥處理廢水中鈾（Ⅵ）的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 原子能科學(xué)技術(shù)， 2015， 49（1）： 26-32. XIE Shui-bo， MA Hua-long， TANG Zhen-ping， LING Hui，ZENG Tao-tao， CHEN Sheng， WANG Jin-song. Study of U（VI）removal by sulfate reducing granular sludge under micro-aerobic condition［J］. Atomic Energy Science and Technology， 2015，49（1）： 26-32.

［10］PENG X， GUO F， JU F， ZHANG T. Shifts in the microbial community， nitrifiers and denitrifiers in the biofilm in a full-scale rotating biological contactor［J］. Environmental Science & Technology， 2014， 48（14）： 8044-8052.

［11］TYUPA D V， KALENOV S V， SKLADNEV D A，KHOKHLACHEV N S， BAURINA M M， KUZNETSOV A Y. Toxic influence of silver and uranium salts on activated sludge of wastewater treatment plants and synthetic activated sludge associates modeled on its pure cultures［J］. Bioprocess Biosyst Eng， 2015， 38（1）： 125-135.

［12］ISLAM E， SAR P. Culture-dependent and -independent molecular analysis of the bacterial community within uranium ore［J］. J Basic Microbiol， 2011， 51（4）： 372-384.

［13］ZHANG C， MALHOTRA S V， FRANCIS A J. Toxicity of ionic liquids to Clostridium sp. and effects on uranium biosorption［J］. Journal of Hazardous Materials， 2014， 264（1）： 246-253.

［14］CHOUDHARY S， SAR P. Uranium biomineralization by a metal resistant Pseudomonas aeruginosa strain isolated from contaminated mine waste［J］. Journal of Hazardous Materials，2011， 186（1）： 336-343.

［15］HANDLEY K M， WRIGHTON K C， PICENO Y M，ANDERSEN G L， DESANTIS T Z， WILLIAMS K H，WILKINS M J， N'GUESSAN A L， PEACOCK A， BARGAR J，LONG P E， BANFIELD J F. High-density PhyloChip profiling of stimulated aquifer microbial communities reveals a complex response to acetate amendment［J］. Fems Microbiology Ecology，2012， 81（1）： 188-204.

［16］MIURA T， UCHINO Y， TSUCHIKANE K， OHTSUBO Y， OHJI S， HOSOYAMA A， ITO M， TAKAHATA Y， YAMAZOE A，SUZUKI K， FUJITA N. Complete genome sequences of sulfurospirillum strains UCH001 and UCH003 isolated from groundwater in Japan［J］. Genome Announc， 2015， 3（2）： 1-2.

［17］李于于. 砂巖型鈾礦中鐵素氧化還原相關(guān)細(xì)菌類群分析［D］.西安：西北大學(xué)， 2013： 36. LI Yu-yu. Community structure of iron-oxidating bacteria and iron-eeducting bacteria in sandstone uranium deposits［D］. Xi'an：Northwestern University， 2013： 36.

［18］SUN R， ZHOU A， JIA J， LIANG Q， LIU Q， XING D， REN N. Characterization of methane production and microbial community shifts during waste activated sludge degradation in microbial electrolysis cells［J］. Bioresour Technol， 2014， 175（1）：68-74.

［19］曹新塏， 楊 琦， 郝春博. 厭氧污泥降解萘動(dòng)力學(xué)與生物多樣性研究［J］. 環(huán)境科學(xué)， 2012， 33（10）： 3535-3541. CAO Xin-kai， YANG Qi， HAO Chun-bo. Degradation kinetics of naphthalene by anaerobic sludge and analysis of the bacterial biodiversity［J］. Environmental Science， 2012， 33（10）：3535-3541.

［20］王學(xué)華， 黃 俊， 宋吟玲， 黃 勇， 李 蕾. 高效水解酸化UASB活性污泥的菌群結(jié)構(gòu)分析［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2014，34（11）： 2779-2784. WANG Xue-hua， HUANG Jun， SONG Yin-ling， HUANG Yong， LI Lei. Analysis on bacterial community structure in UASB reactor's sludge with hydrolysis acidification capacity of dyeing wastewater treatment process［J］. Acta Scientiae Circumstantiae，2014， 34（11）： 2779-2784.

［21］吳俊妹， 馬安周， 崔萌萌， 于 清， 齊鴻雁， 莊緒亮， 莊國(guó)強(qiáng).降解纖維素產(chǎn)甲烷的四菌復(fù)合系［J］. 環(huán)境科學(xué)， 2014， 35（1）：327-333. WU Jun-mei， MA An-zhou， CUI Meng-meng， YU Qing， QI Hong-yan， ZHUANG Xu-liang， ZHUANG Guo-qiang. Bioconversion of cellulose to methane by a consortium consisting of four microbial strains［J］. Environmental Science，2014， 35（1）： 327-333.

［22］JIANG J， NAKAYAMA J， SAKAMOTO N， 等. 454 pyrosequencing study on the basal microbiota of healthy asian youngsters［C］//第七屆乳酸菌與健康國(guó)際研討會(huì)暨第三屆亞洲乳酸菌研討會(huì)，無錫： 中國(guó)科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)， 2012： 2. JIANG J， NAKAYAMA J， SAKAMOTO N， et al. 454 pyrosequencing study on the basal microbiota of healthy asian youngsters［C］//The 7th International Symposium on Lactic Acid Bacteria and Health & The 3rd Asian Symposium on Lactic Acid Bacteria Abstracts. Wuxi： Chinese Institute of Food Scinece and Technology， 2012： 2.

［23］黃 龍. 堿和接種物對(duì)剩余污泥厭氧酸化及其微生物群落多樣性的作用機(jī)理［D］. 廣州： 華南理工大學(xué)， 2014： 49-50. HUANG Long. Inoculation and alkali coeffect in volatile fatty acids production and microbial community shift in the anaerobic fermentation of waste activated sludge［D］. Guangzhou： South China University of Technology， 2014： 49-50.

［24］周軒宇. 新型厭氧反應(yīng)器處理造紙廢水效能及功能菌群落分析［D］. 廣州： 華南理工大學(xué)， 2014： 49-51. ZHOU Xuan-yu. Performance and functional bacteria community characteristics of a new anaerobic reactor treating papermaking wastewater［D］. Guangzhou： South China University of Technology， 2014： 49-51.

（編輯 李艷紅）

Analysis of microbial community structure of uranium-resistant granular sludge

ZENG Tao-tao1， 2， LU Hui-zhen2， LIU Ying-jiu2， LIU Jin-xiang2， RONG Li-shan2， MA Hua-long2， XIE Shui-bo2， 3
（1. Postdoctoral Research Centre of Mining Engineering， University of South China， Hengyang 421001，China；
2. Hunan Province Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse Technology，University of South China， Hengyang 421001， China；
3. Key Discipline Laboratory for National Defence for Biotechnology in Uranium Mining and Hydrometallurgy，University of south China， Hengyang 421001， China）

Anaerobic granular sludge was used for uranium removal under various U （Ⅵ） concentrations （2.4-12 mg/L）. The environmental scanning electron microscope （ESEM） and high throughput sequencing were carried out for microbial community structure analysis. The results show that the maximum uranium removal rate of 95.1% is achieved under the conditions of initial U（Ⅵ） concentration of 9.6 mg/L， pH value of 6 and wet sludge of 2g （the volatile suspended solid concentration is 0.1g）. ESEM results show that the spherical bacteria with diameters of 1 μm is the dominant microorganisms in granular sludge. The energy dispersive spectrum （EDS） proves the existence of uranium in the cell surface. The total dataset comprises 15939 high quality sequences， which can be divided into 939 operational taxonomic units. There are high microbial diversity and abundance in the granular sludge as the library coverage is 0.967， and the Shannon index， ACE index and Chao1 index are 4.099， 3140.55 and 2122.53， respectively. Genus classification indicates that there are many typical uranium-reducing or precipitated bacteria， such as Acinetobacter， Clostridium， Pseudomonas，Sulfurovum， Sulfurospirillum and Trichococcus， which contributes to high efficiency of uranium removal and uranium-resistant property in the granular sludge.

uranium-resistant property； granular sludge； microbial community； high throughput sequencing

Foundation： Projects （51408293， 11475080） supported by the National Natural Science Foundation of China； Project （2014M562114） supported by the China Postdoctoral Science Foundation； Project （14B154） supported by the Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department， China； Project （2014SBH01） supported by the Postdoctoral Foundation of Hunan Province， China； Project （2013XQD10） supported by the Research Fund for Doctoral Program of University of South China， China

XIE Shui-bo； Tel： +86-734-8281603； E-mail： xiesbmr@263.net

1004-0609（2016）-01-0233-09

X172

A

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（51408293，11475080）；中國(guó)博士后基金面上項(xiàng)目（2014M562114）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金資助項(xiàng)目（14B154）；湖南省博士后日常資助項(xiàng)目（2014SBH01）；南華大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目（2013XQD10）

2015-05-19；

2015-09-02

謝水波，教授，博士；電話：0734-8281603；E-mail：xiesbmr@263.net