纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和鑒定

魏亞琴邵建寧麻和平張文齊

楊 勇3劉彩云1趙昊星1慕婷婷1

（1.甘肅省科學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.南開大學(xué)生命科學(xué)院，天津 300071）

纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選和鑒定

魏亞琴1，2邵建寧1麻和平1張文齊1

楊 勇3劉彩云1趙昊星1慕婷婷1

（1.甘肅省科學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.南開大學(xué)生命科學(xué)院，天津 300071）

從蘭州榆中縣興隆山國家自然保護區(qū)采集土樣，先用羧甲基纖維素鈉剛果紅培養(yǎng)基篩選出79株Hc值較大的產(chǎn)纖維素酶菌株，再經(jīng)液體發(fā)酵復(fù)篩測CMC酶活和濾紙酶活。結(jié)果表明，經(jīng)復(fù)篩后菌株No－15A的纖維素酶活力最高，羧甲基纖維素酶活1 376.20U/mL，濾紙酶活497.78U/mL，其粗酶液分解濾紙快速明顯，且該菌株生長速度最快，每日菌落直徑增長量為4～5cm。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定菌株No－15A屬青霉。

纖維素酶；羧甲基纖維素酶活；濾紙酶活；青霉

纖維素是自然界分布最廣泛、最豐富、最廉價的多糖物質(zhì)，是植物細胞壁主要成分［1］，也是地球上年產(chǎn)量最大，具有巨大潛力的可再生天然資源。據(jù)估計，纖維素生成量每年高達1 000多億t，中國每年農(nóng)作物秸稈總產(chǎn)量為7億多t，僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘渣，如稻草、玉米秸、麥秸，每年就5億t之多［2］，目前這些資源大部分通過簡單焚燒，在浪費能源的同時也對環(huán)境造成污染。隨著石油、煤炭、天然氣等不可再生資源日漸耗竭，有效轉(zhuǎn)化，科學(xué)利用數(shù)量極其龐大的纖維素資源具有廣闊的前景［3］。利用纖維素酶水解纖維素成葡萄糖并進一步發(fā)酵轉(zhuǎn)化成燃料乙醇、SCP飼料蛋白和各種平臺化合物等，對緩解全球能源危機、飼料資源和化工原料緊張，保護環(huán)境等均具有重大意義［4］。

纖維素酶是一組降解纖維素生成葡萄糖的復(fù)雜酶系，完整的纖維素酶系由3類酶組成：內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶，它作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解1，4－糖苷鍵，產(chǎn)生大量有非還原端的小分子纖維素；外切β－1，4－葡聚糖酶，它主要作用于纖維素線狀分子末端，水解β－1，4－糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子；β－葡萄糖苷酶，它的作用是水解纖維二糖及低分子量的纖維寡糖生成葡萄糖［5］。3種酶必須比例合理，才能很好地發(fā)揮協(xié)同降解纖維素的作用。

從自然界篩選纖維素酶高產(chǎn)菌是構(gòu)建高效纖維素分解技術(shù)的基礎(chǔ)性工作［6］。甘肅省蘭州榆中縣境內(nèi)的興隆山森林覆蓋率高、雨水充沛、氣候溫涼濕潤，形成了極其豐富的微生物資源。本試驗擬從興隆山森林土壤中分離篩選出產(chǎn)纖維素酶活較高的菌株，以便進一步研究開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

吐溫－80：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

新華1號濾紙：蘭州化學(xué)物理研究所；

硝基水楊酸試劑：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；

分光光度計：721型，武漢邁新醫(yī)療設(shè)備有限公司；

光學(xué)顯微鏡：AQ－2010C，上海光學(xué)儀器廠。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基 羧甲基纖維素鈉5g，K2HPO41g，NaNO33g，KCL 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂17g，蒸餾水1 000mL。pH值5.5～6.0。

1.2.2 斜面活化保藏培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯200g，麥芽糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL。pH自然。

1.2.3 液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 微晶纖維素粉10g，麩皮10g，（NH4）2SO43g，MgSO40.4g，CaCl2 0.4g，KH2PO41g，吐溫－801mL，酵母膏 0.5g，蛋白胨 2g，蒸餾水1000mL。pH自然。培養(yǎng)基均在0.11MPa，121 ℃，滅菌30min備用。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 在興隆山次生林區(qū)采集距表層5cm處的潮濕腐質(zhì)土壤、枯葉、腐爛朽木等。

1.3.2 菌株的初篩 稱取樣品適量，剪碎研磨后加入100mL滅菌生理鹽水，并帶玻璃珠的三角瓶中充分振搖均勻，稍靜置后取上清液用無菌生理水稀釋后涂布到初篩培養(yǎng)基表面，即羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)4～5d后，往長菌平板中加入適量1mg/mL剛果紅溶液，染色1h，棄去染液后，加入適量1mol/L的NaCl溶液洗滌，挑選產(chǎn)水解圈直徑與菌落直徑比值Hc較大的菌落于初篩培養(yǎng)基劃線分離純化后接入斜面活化保藏培養(yǎng)基。

1.3.3 菌株的復(fù)篩 將初篩獲得的菌株制備濃度為107個/mL的孢子懸液，取4mL接種于內(nèi)裝40mL液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基［7］的容積為250mL的三角瓶中。旋轉(zhuǎn)式搖床220r/min培養(yǎng)，發(fā)酵48h前30℃，48h后28℃，發(fā)酵第6天檢測酶活，篩選出CMC酶活和濾紙酶活均較高的菌株。

1.3.4 酶活測定 采用DNS法測定CMC酶活和濾紙酶活［8］。CMC酶活和濾紙酶活單位定義是：以CMCNa或新華濾紙為底物，在pH 4.8，50℃，1mL酶液1min水解底物生成1μg葡萄糖為1個酶活單位，以U表示。

1.3.5 纖維素酶高產(chǎn)菌生長速度及形態(tài)學(xué)鑒定 初篩和復(fù)篩篩選出CMC酶活和濾紙酶活同時較高的菌株。將其接種到馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，28～30℃培養(yǎng)，連續(xù)觀察平板上菌株從開始生長到產(chǎn)大量孢子過程中菌落生長狀況，測量菌落每日直徑增長量，計算菌落生長速度。觀察菌落顏色、大小、邊緣和表面質(zhì)地、紋飾、滲出物、氣味及菌落在平板正反面顏色，培養(yǎng)基顏色，菌絲長勢、生長密度，產(chǎn)孢時間、孢子顏色及每日產(chǎn)孢量變化等。

絲狀真菌制片［9］：載片中央滴加一小滴乳酸石炭酸溶液，然后用接種針從菌落邊緣挑取少許菌絲體和孢子置于其中攤開，低倍鏡和高倍鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、分生孢子鏈、分生孢子等形態(tài)。

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察菌落形態(tài)，鏡檢菌絲及分生孢子梗、孢子鏈、孢子形態(tài)，并結(jié)合《真菌鑒定手冊》［10］，將菌株相應(yīng)特征與檢索表中對比，進行被選菌株形態(tài)學(xué)的初步分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩

土樣稀釋液涂布于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板表面，培養(yǎng)至第6天用剛果紅染色法觀察水解圈，有200多個菌落周圍產(chǎn)生了清晰水解圈，有真菌、細菌、放線菌。菌落有透明、粉紅、乳白、墨綠、青綠、灰綠、黃綠、黃褐、桔黃、灰白、黑色等。從中挑選了水解圈與菌落直徑比值Hc較大的纖維素酶產(chǎn)生菌確定為初選菌株。形態(tài)觀察初選菌株以真菌為主，還有較多細菌和個別放線菌，真菌中以霉菌為主。見圖1。

圖1 菌株No－15A在羧甲基纖維素鈉平板上產(chǎn)生的水解圈Figure 1 Transparent circle on CMCNa culture medium of the strain No－15A

2.2 菌株的復(fù)篩

初選菌株發(fā)酵產(chǎn)酶后，測其粗酶液的酶活，測3次取平均值。以酶活值為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)篩選出CMC酶活和濾紙酶活同時較高的15株，且其形態(tài)以霉菌為主。由表1可知，No－15A的菌株酶活最高，其 CMC酶活1 376.2U/mL，F(xiàn)PA酶活497.78U/mL。由圖2可知，菌株 No－15A 的稀釋粗酶液0.5mL與50mg濾紙條于pH 4.8，反應(yīng)1h后，稀釋粗酶液對濾紙條分解效果明顯。

2.3 纖維素酶高產(chǎn)菌生長速度及形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株No－15A接種于PDA培養(yǎng)基，恒溫箱28℃培養(yǎng)，生長十分迅速，接種培養(yǎng)基第1天開始長出菌落，并在培養(yǎng)基上迅速擴散；第2天菌落直徑達5～6cm，菌絲濃密粗壯，交聯(lián)狀態(tài)好，有橫隔，且極易產(chǎn)生分生孢子；第3天菌落直徑達9～10cm，菌落長滿覆蓋整個培養(yǎng)皿，且產(chǎn)孢量多。菌株生長速度是：每日直徑增長量為（4±0.5）cm。將菌株No－15A接種在PDA，恒溫箱30℃培養(yǎng)，菌落長勢依然旺盛，菌落每日直徑增長略大（4±0.5）cm，生長速度稍快。經(jīng)與其它14株菌生長形態(tài)及菌落直徑大小做對比可知：菌株No－15A的生長速度最快。

表1 纖維素酶產(chǎn)生菌酶活Table 1 Enzyme activity of the cellulase－producing strains

圖2 菌株No－15A粗酶液分解濾紙條Figure 2 Decomposition for filter paper strip of the strain No－15A’s cellulase

菌株No－15A在PDA培養(yǎng)基上菌落呈氈狀，質(zhì)地致密厚實，與培養(yǎng)基連接緊密；菌落有特殊香味；菌落轉(zhuǎn)色快，正面淡灰綠色，外圍有較窄白色菌絲圈帶；菌落背面淡茶褐色至黃褐色；并隨培養(yǎng)時間逐漸加深；菌絲有橫隔膜，細胞中有細胞核；分生孢子梗從菌絲垂直生出集成束狀，其頂端有一至多次分枝呈掃帚狀，掃帚枝最后一級分枝是產(chǎn)生分生孢子的小梗，每一小梗頂端著生成串分生孢子，分生孢子串呈不分枝鏈狀；孢子橢圓形，光滑，呈青綠色。據(jù)菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果初步鑒定菌株No－15A是真菌門，半知菌亞門，絲孢綱，從梗孢目，叢梗孢科，從梗孢科單胞亞科，曲霉族，青霉屬（Penicillium）。見圖3和圖4。

圖3 菌株No－15A的菌落形態(tài)Figure 3 Colony morphology of the strain No－15A

圖4 鏡檢菌株No－15A的菌絲和分生孢子形態(tài)Figure 4 Mycelium and conidiospore morphology of the strain No－15Aby microscope

3 結(jié)論

（1）采用羧甲基纖維素鈉剛果紅方法篩選纖維素酶產(chǎn)生菌，雖然較繁瑣，但它是一種有效的篩選方法。

（2）興隆山森林土壤中蘊含著多種可有效分解纖維素的微生物，其中真菌占大多數(shù)。

（3）篩選得到的纖維素酶高產(chǎn)菌株No－15A，經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定為青霉屬，其酶活最高，生長十分迅速，值得進一步研究。今后將繼續(xù)通過理化誘變或發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化進一步提高菌株No－15A的CMC酶活和濾紙酶活，為工業(yè)應(yīng)用提供纖維素酶高產(chǎn)菌優(yōu)質(zhì)菌株。

1 封曄，來航線，鄭真.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，35（10）：133～138.

2 侯進慧，劉全德，高明俠.胡蘿卜表面產(chǎn)纖維素酶細菌初步鑒定分析［J］.食品科學(xué)，2010，31（5）：233～236.

3 朱濤.一株絲狀真菌胞外中性纖維素酶系的分離純化與酶功能的研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2008.

4 肖舸，雷芳，喻東，等.一株產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.四川大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，41（2）：422～425.

5 Qin Zhang，Chi－Ming Lo，Lu－Kwang Ju.Factors affecting foaming behavior in cellulose fermentation byTrichoderma reeseiRutC－30［J］.Bioresourcetechnology，2007，98（4）：753～760.

6 Zhou XG，Smith Joseph A，Oi Faith M，et al.Correlation of cellulose gene expression and cellulolytic activity throughout the gut of the termite reticulitermes flavipes［J］.Gene，2007，395（12）：29～39.

7 陳文祥.產(chǎn)纖維素酶放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)初探［D］.成都：四川師范大學(xué)，2007.

8 李忠玲.產(chǎn)堿性纖維素酶放線菌的篩選及其產(chǎn)酶條件與酶學(xué)性質(zhì)初步研究［D］.西安：西北大學(xué)，2008.

9 錢存柔，黃儀秀.微生物學(xué)實驗教程［M］.北京：北京大學(xué)出版社，1999.

10 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

Screening and identification of a high－yield cellulase strain

WEI Ya－qin1，2SHAO Jian－ning1MA He－ping1ZHANGWen－qi1

YANG Yong3LIU Cai－yun1ZHAO Hao－xing1MU Ting－ting1

（1.Gansu Science Acdemics，Lanzhou，Gansu730000，China；2.Life school of lanzhou university，Lanzhou，Gansu730000，China；3.College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin300071，China）

The Xinglong Mountain in Yuzhong county of Lanzhou is a national nature reserve.Soil samples were collected from the forest area at the Xinglong Mountain.These samples were firstly screened by CMCNa Congo Red culture medium，and 79cellulase－producing strains were selected with larger Hc value.And then，these cellulase－producing strains were fermented and CMCase activity and FPA were measured.The experiment results show the activity of the strain No－15Awas highest.Its FPA activity was 497.78U/mL，and CMCase activity was 1376.20U/mL.The enzyme solution of the strain No－15Amade filter paper rotten very fast，and it’s colony growed more quickly than the other 14strains，the colony diameter increased a day is 4～5cm.according to the morphology characteristics，the strain No－15AisPenicillium.

cellulase；CMCase activity；FPA；Penicillium

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.006

甘肅省科技計劃資助（編號：1010RJZA169）

魏亞琴（1974－），女，甘肅省科學(xué)院工程師，碩士。E－mail：weiyq04＠lzu.cn

2010－05－20