131I-1H12的制備及對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的結(jié)合及生物學(xué)效應(yīng)研究

殷寧，杜明華，鐘英，曲海船

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，江蘇南京 210009)

表皮生長因子受體(EGFR)在非小細(xì)胞肺癌的治療中已成為一個(gè)重要的靶點(diǎn)，目前針對EGFR的肺癌靶向治療藥物(易瑞沙、特洛凱等)早已進(jìn)入臨床應(yīng)用［1-2］。為研究應(yīng)用抗EGFR抗體進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌放射免疫顯像及治療的可能性，本實(shí)驗(yàn)通過放射性碘標(biāo)記EGFR單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)1H12，探討了131I-1H12與人肺癌細(xì)胞A549在體外結(jié)合情況及其生物學(xué)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 A549細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系22代，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。

1.2 主要儀器

FH463A自動定標(biāo)器(西安二六二廠核儀器分廠);RM-905a活度計(jì)(中國計(jì)量科學(xué)研究所);HERA Cell CO2培養(yǎng)箱(美國Kendro公司);Eppendorf cenhifuge低溫冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);YJ-875超凈工作臺(蘇州蘇凈凈化設(shè)備有限公司);流式細(xì)胞儀:FACS Vantage SE型。

1.3 主要試劑

鼠抗人EGFR McAb(1H12):美國CST公司產(chǎn)品，純度＞98%。Na131I溶液:中國核動設(shè)計(jì)院第一研究所(無還原劑、無載體)產(chǎn)品。Iodogen(四氯二苯基甘脲):美國Sigma公司產(chǎn)品。葡聚糖凝膠G-50(SephadexG-50):瑞典Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640培養(yǎng)液:Gibcobrl公司產(chǎn)品。胎牛血清(FCS):杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。

1.4 131I-1H12 的標(biāo)記與鑒定［3］

(1)標(biāo)記前準(zhǔn)備:將Iodogen溶解于二氯甲烷中制成濃度為 1 μg·μl-1的 Iodogen 溶液，取 100 μl加入乙烯Eppendorf管中，氮?dú)獯蹈珊笤谠嚬艿撞績?nèi)壁形成一層均勻的Iodogen膜，制備完成后保存于4℃?zhèn)溆谩?2)Iodogen法131I標(biāo)記1H12:在涂布 Iodogen的 Eppendorf管中依次加入0.5 mol·L-1、pH 7.6 的磷酸鹽緩沖液 50 μl，1H12 25.0 μg(pH 7.6 PBS 溶解，濃度1 μg·μl-1)，Na131I 46.25 MBq，充分混勻后在室溫下反應(yīng)10 min，其間溫和振蕩數(shù)次。(3)分離純化反應(yīng):將反應(yīng)液滴加于預(yù)先經(jīng)PBS(0.01 mol·L-1、pH 7.4)平衡、2%牛血清白蛋白封閉飽和的SephadexG-50層析柱上，用0.01 mol·L-1、pH 7.4 的 PBS 洗脫層析柱，自動收集器收集部分洗脫液，流速每管1.0 ml·min-1，共收集20管，按收集時(shí)間順序排列各管;RM905放射性活度計(jì)測定各管的活度，以Rf為橫坐標(biāo)，對應(yīng)各管的放射性活度為縱坐標(biāo)，制作時(shí)間-放射性活度洗脫曲線。(4)放射化學(xué)純度(radio chemical purity，RCP)測定:生理鹽水紙層析法測定標(biāo)記物RCP。(5)計(jì)算標(biāo)記率、放射濃度:標(biāo)記率=蛋白峰各管放射性活度總和/蛋白峰加游離峰各管放射性活度之和;放射濃度=投入的Na131I總量×標(biāo)記率/蛋白峰收集的總ml數(shù)。(6)比活度的測定:放射性比活度=投入的Na131I總量×標(biāo)記率/投入的1H12量。(7)131I-1H12的體外穩(wěn)定性，置于室溫37℃，于第24小時(shí)、48小時(shí)、72天測定各自放射化學(xué)純度，評價(jià)其體外穩(wěn)定性。(8)131I-1H12收集液過濾除菌備用。

1.5 131I-1H12對A549細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)

(1)A549細(xì)胞EGFR表達(dá)率:取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至106ml-1，用-20℃預(yù)冷的80 ml·L-1乙醇固定過夜，流式細(xì)胞測定EGFR的表達(dá)率。(2)131I-1H12免疫活性的鑒定:常規(guī)培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞株(A549)、臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液調(diào)至細(xì)胞濃度1×106ml-1，兩種細(xì)胞分別裝入6孔培養(yǎng)板使細(xì)胞濃度在1×106細(xì)胞·(1.0 ml)-1·孔-1(足量)，每組細(xì)胞中分別加入131I-1H12(105 cpm)，搖勻，常規(guī)培養(yǎng)12 h，每2 h振蕩1次，培養(yǎng)12 h后將每孔的上清液移入試管，0.25 ml胰蛋白酶消化A549細(xì)胞與臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞移入裝有相應(yīng)上清液的試管。在FH463A自動定標(biāo)器上測定每孔的總放射性。1 000 r·min-1離心5 min，去上清液。沉淀用PBS洗滌3次，最后測沉淀物放射性。按如下公式計(jì)算體外細(xì)胞結(jié)合率:體外細(xì)胞結(jié)合率(%)=沉淀部分放射性計(jì)數(shù)(cpm)/總放射性計(jì)數(shù)(cpm)×100%［4］。(3)藥物實(shí)驗(yàn)分組:將24瓶對數(shù)生長期A549細(xì)胞分成A～F 6組，每組4瓶，A、B、C組分別加入131I-1H12 148、74、37 kBq，D 組加入 Na131I溶液 148 kBq，E 組加入 1H12 80 nmol·L-1，F(xiàn) 組加入等量培養(yǎng)液［5］。(4)檢測131I-1H12對細(xì)胞的生物學(xué)作用:給藥后的各組細(xì)胞用小鉛磚分隔培養(yǎng)12 h后換液(普通培養(yǎng)液)，繼續(xù)分隔培養(yǎng)36 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，收集細(xì)胞以調(diào)整濃度至106ml-1，用-20℃預(yù)冷的80 ml·L-1乙醇固定過夜，并用以 AnnexinⅤ-FIFC/PI雙染法測定藥物對細(xì)胞的早期誘導(dǎo)凋亡作用，采用DNA 倍體分析法檢測細(xì)胞周期［4，6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SPSS 13.0軟件處理，采用方差分析;兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR McAb131I-1H12的標(biāo)記及鑒定

Iodogen法碘化標(biāo)記McAb(1H12)，經(jīng)SephadexG-50柱層析分離游離碘和EGFR McAb131I-1H12，從洗脫曲線上(圖1)可見:131I-1H12蛋白峰出現(xiàn)在第3、4、5管;游離碘峰出現(xiàn)在第10、11、12管。標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行紙層析，根據(jù)公式計(jì)算其標(biāo)記率為50.14%，比活度為4.63 MBq·μg-1，其放射濃度為 77.31 MBq·ml-1，生理鹽水紙層析法測定放射性化學(xué)純度為96.92%。24、48、72 h我們測得的放射性化學(xué)純度依次為95.33%、94.79%和91.03%，說明標(biāo)記產(chǎn)物在體外具有較好穩(wěn)定性。

圖1 洗脫曲線Fig 1 Elution curve

2.2 標(biāo)記抗體131I-1H12的免疫活性

標(biāo)記抗體經(jīng)體外細(xì)胞結(jié)合分析顯示131I-1H12與A549細(xì)胞體外結(jié)合率達(dá)61.12%，而與人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞不發(fā)生特異性體外結(jié)合，其結(jié)合率僅為7.16%，和前者比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。說明:(1)1H12經(jīng)131I Iodogen法標(biāo)記后保持有良好的免疫結(jié)合特性。(2)131I-1H12與A549細(xì)胞呈特異性結(jié)合。

2.3 131I-1H12對A549細(xì)胞的生物學(xué)作用

流式細(xì)胞儀測得A549細(xì)胞的EGFR表達(dá)率為75%。光鏡下細(xì)胞形態(tài)改變［7］:倒置顯微鏡下見A、B、C組A549細(xì)胞不同程度變圓，胞體皺縮，細(xì)胞輪廓漸趨模糊，形態(tài)異常。有的細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞質(zhì)粗糙，顆粒明顯增多，出現(xiàn)堆積現(xiàn)象，多數(shù)細(xì)胞脫壁，漂浮于培養(yǎng)液中。而F組細(xì)胞未見有上述現(xiàn)象，細(xì)胞生長旺盛，有很多分裂相(圖2)。流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡(表1):通過亞G1峰檢測其凋亡率分別為A組(44.35±3.31)%、B組(16.29±2.76)%、C組(9.36±2.32)%、D組(8.03±1.38)%、E組(1.51±0.79)%、F組(1.44±0.34)%，各組與 F組比較，細(xì)胞凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，A、B、C組的凋亡率隨放射性濃度增加而升高。細(xì)胞周期阻滯亦隨藥物劑量增加而升高，從(33.84±1.92)%升高至(51.17±2.98)%，呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系(圖3、4)。A組與D組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明發(fā)揮腫瘤殺傷作用的是與細(xì)胞結(jié)合的131I-1H12。

圖2 倒置顯微鏡下A549細(xì)胞形態(tài)比較Fig 2 Comparison of A549 cell morphology under inverted microscope

表1 各組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率(±s) %Tab 1 Cell cycles analysis and apoptosis rates of different sub-groups(±s) %

表1 各組細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率(±s) %Tab 1 Cell cycles analysis and apoptosis rates of different sub-groups(±s) %

與F組相比，a P＜0.01，b P＜0.05;未標(biāo)記的表明無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

組別細(xì)胞周期G0/G1 S G2/M細(xì)胞凋亡率(subG1)A組 29.46±1.34a19.37±1.08 51.17±2.98a44.35±3.31a 57.77±2.77 29.69±2.98 22.54±1.18 1.44±0.34 B組35.37±2.12a21.41±1.33 43.22±1.73a16.29±2.76a C組40.03±3.69a26.13±3.12 33.84±1.92a9.36±2.32b D組37.32±0.92a31.50±2.03 31.18±1.09a8.03±1.38b E組 56.07±3.87 30.88±0.96 19.05±1.35 1.51±0.79 F組

圖3 各組細(xì)胞周期及凋亡柱狀圖Fig 3 Histogram of cell cycles and apoptosis of different sub-groups

圖4 各組凋亡圖示例Fig 4 Examples of each group's apoptosis diagram

3 討 論

鼠抗人EGFR McAb(1H12)系免疫球蛋白IgG，分子質(zhì)量為17.5 kDa，本實(shí)驗(yàn)以Iodogen法對1H12進(jìn)行131I標(biāo)記，標(biāo)記率為50.14%，放化純度＞95%，在體外穩(wěn)定性良好?？贵w的同位素標(biāo)記技術(shù)中最重要的是要保持抗體尤其是McAb的生物、免疫學(xué)活性，否則即使標(biāo)記工作做得再好也無法將標(biāo)記抗體應(yīng)用于下一步的實(shí)驗(yàn)或臨床領(lǐng)域。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)抗EGFR McAb(1H12)經(jīng)碘化標(biāo)記以后保持原有的免疫學(xué)活性，131I-1H12能與肺癌A549細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。

已有研究表明，細(xì)胞周期的阻滯與細(xì)胞凋亡、分化密切相關(guān)，細(xì)胞通過2個(gè)限制點(diǎn)(G0/S期和G2/M期限制點(diǎn))保證細(xì)胞的復(fù)制［8］。細(xì)胞受損時(shí)，通過激活限制點(diǎn)分別導(dǎo)致細(xì)胞的G0期或G2期延遲，使細(xì)胞有時(shí)間完成復(fù)制前和有絲分裂前的修復(fù)，以保證細(xì)胞存活;當(dāng)損傷超過細(xì)胞的修復(fù)能力時(shí)，則促使細(xì)胞凋亡。為探討131I-1H12對A549細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，我們使用流式細(xì)胞術(shù)對各組A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期的變化進(jìn)行了觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥48 h后A、B、C組A549細(xì)胞隨著藥物放射性活度增強(qiáng)，G0/G1期細(xì)胞逐漸減少，G2/M期細(xì)胞明顯增多，呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。凋亡率也由(9.36±2.32)%升至(44.35±3.31)%，說明A549細(xì)胞抑制作用可能與G2/M期阻滯有關(guān)。C組與D組的凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說明小劑量長時(shí)間131I-1H12與大劑量短時(shí)間Na131I對A549細(xì)胞的凋亡作用相當(dāng)。

有研究表明大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EGFR能夠高密度表達(dá)和(或)發(fā)生突變，而正常人肺組織EGFR表達(dá)呈陰性［1］。目前以肺癌EGFR為靶點(diǎn)的腫瘤靶向治療方法較多，很多靶向藥物已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床。我們選用高敏感性鼠抗人EGFR McAb(1H12)做了放射性碘標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)，并探討了標(biāo)記后的131I-1H12對EGFR表達(dá)陽性(75%)的A549細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，為體內(nèi)進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌EGFR為靶點(diǎn)的放射免疫顯像及治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［9-10］。與以往單純的抗肺癌單克隆抗體介導(dǎo)的放射免疫治療相比［11-12］，131I-1H12并不僅僅作為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療藥，只要是高表達(dá)EGFR的腫瘤都能適用，且運(yùn)用低劑量131I-1H12進(jìn)行腫瘤EGFR的放射免疫顯像，可作為其他針對EGFR的靶向治療初篩條件［2］，從而減少不必要的醫(yī)療資源消耗。雖然運(yùn)用表皮生長因子(EGF)作為核素的載體，同樣可以達(dá)到對腫瘤的EGFR靶向治療的效果［13］，考慮到EGF本身作為促進(jìn)腫瘤生長的因素之一，其作為放射性核素載體在實(shí)際的臨床應(yīng)用的安全性仍將受到質(zhì)疑。綜上所述，無論用放射免疫顯像進(jìn)行腫瘤表達(dá)EGFR與否的分類和初篩，還是本身作為靶向治療劑，放射性核素標(biāo)記EGFR單克隆抗體都具有潛在而可觀的應(yīng)用前景［14-15］。

關(guān)于131I-EGFR McAb對體內(nèi)非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，筆者將在接下來的工作中繼續(xù)深入研究。相信隨著研究的不斷深入，必將使非小細(xì)胞肺癌的此類靶向診斷及治療模式逐漸趨于完善。

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