胰腺癌肝轉移相關分泌蛋白質的篩選

胡方方，周家華

(東南大學附屬中大醫(yī)院肝膽外科，江蘇南京 210009)

胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤，而胰腺癌肝臟轉移是導致胰腺癌治療失敗的主要原因之一［1］，腫瘤的轉移是一個高度有序的、非隨機的、器官特異性的過程。近來研究顯示，腫瘤細胞可分泌一些可溶性蛋白誘導一群非腫瘤性的骨髓前體細胞，動員并植入遠處特定的器官組織形成“預轉移的小生境(the pre－metastatic niche)”，從而招募循環(huán)腫瘤細胞至特定的位點形成轉移結節(jié)，而腫瘤細胞分泌的特定蛋白質在此過程中起關鍵作用，它們決定著腫瘤轉移器官分布的特異性［2－3］。因此，篩選及鑒定與胰腺癌肝轉移相關的分泌蛋白質對于闡明胰腺癌定向肝轉移機制，尋找胰腺癌肝轉移早期診斷、預后判斷及藥物治療新靶點均具有重要意義。

本研究采用蛋白組學技術，分析比較一對來自同一親本、具有不同肝轉移潛能的胰腺癌細胞株分泌蛋白質的差異表達，以期篩選出與胰腺癌肝轉移相關的分泌蛋白質，為尋找早期診斷胰腺癌肝轉移的蛋白質標志物提供實驗依據(jù)，亦為闡明胰腺癌定向肝轉移的細胞及分子機制提供初步理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人高肝轉移潛能胰腺癌細胞株L3.6 pl由美國德州大學安德森腫瘤中心提供，人低肝轉移潛能胰腺癌細胞株Colo－357由本實驗室保存，前者為后者經(jīng)裸鼠活體內連續(xù)篩選六輪獲得［4］，二者具有完全相同的遺傳背景。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶系Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清系杭州四季青公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒系碧云天公司產(chǎn)品;固相化pH梯度干膠條(IPG strip，24 cm，pH 3 ～10)、IPG 緩沖液(pH 3 ～10)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、尿素(Urea)、CHAPS、過硫酸銨、碘乙酰氨(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)均系通用公司產(chǎn)品;硝酸銀、溴酚藍、低熔點瓊脂糖、硫代硫酸鈉、甘油、EDTA、無水碳酸鈉、冰醋酸均為國產(chǎn)分析純試劑;質譜級胰蛋白酶、鐵氰化鉀、三氟乙酸(TFA)、碳酸氫銨、乙腈(CAN)和基質α－氰基－4－羥基肉桂酸(CCA)為Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器及生物信息學軟件 恒溫細胞培養(yǎng)箱系Espec公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡系日本Olympus公司產(chǎn)品;IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALTⅢ垂直電泳槽、Image scanner掃描儀、Image master凝膠圖像分析軟件系 Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品;超濾離心管(截留相對分子質量10 000)系德國賽多利斯公司產(chǎn)品;MALDI－TOF－MS 質譜儀、Data Explorer質譜分析軟件系Applied Biosystem公司產(chǎn)品;Mascot肽質量指紋圖數(shù)據(jù)庫查詢軟件系Matrixscience公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)L3.6 pl和 Colo－357細胞至80%左右融合，棄去培養(yǎng)基，PBS緩沖液輕柔洗滌5遍后加入無血清、無酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細胞分泌蛋白質的提取 收集兩種細胞的培養(yǎng)上清，于4℃下分別以1 000×g、3 000×g離心以去除殘留細胞，吸取上清，利用直徑0.45 μm的無菌濾器過濾以進一步去除細胞碎片，再使用分子截留量為10 000的超濾離心管對培養(yǎng)上清于4℃、5 000×g離心6 h行超濾處理，反復重復3次，以濃縮蛋白樣品并除鹽。采用BCA蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白濃度，蛋白樣品分裝后于－80℃凍存。

1.2.3 分泌蛋白質的雙向電泳 將24 cm固相化pH梯度干膠條置于溶脹盤內水化過夜，將水化充分的IPG膠條轉移至通用型杯上樣膠條槽，將濃縮除鹽后的蛋白樣品(200 μg)經(jīng)上樣杯方式加至IPG膠條內，使用IPGphor等電聚焦儀進行第一向等電聚焦，參數(shù)設置為:(1)低電壓水化，30 V 6 h，60 V 6 h;(2)升壓，500 V 1 h step，1 000 V 1 h step;(3)梯度除鹽，3 000 V 3 h gradient，8 000 V 3 h gradient;(4)等電聚焦，8 000 V step 8～10 h。待24 cm膠條等電聚焦達到80 000 Vh時，結束第一向等電聚焦。等電聚焦結束后將IPG膠條依次于10 ml平衡液Ⅰ(50 mmol·L－1pH 8.8 的Tris－HCl，6 mmol·L－1尿素，30% 甘油，2%SDS，痕量溴酚藍，1%DTT)和 10 ml平衡液Ⅱ(50 mmol·L－1tris－HCl，pH 8.8，6 mmol·L－1尿素，30%甘油，2%SDS，痕量溴酚藍，3%碘乙酰氨)中平衡15 min。平衡后的IPG膠條轉移至12.5%SDS－PAGE膠上端，在Ettan DALTⅢ垂直電泳槽上進行第二向垂直電泳。參數(shù)設置為 P1 2 W·膠－1，30 min;P2 5 W·膠－130 min;P3 15 W·膠－16 h。在溴酚蘭前緣運行到凝膠底部邊緣時，終止電泳。剝離取下凝膠，將凝膠在固定液(無水乙醇100 ml、無水冰醋酸25 ml)中固定30 min，然后在敏化液作用30 min，蒸餾水漂洗后加入銀染液［硝酸銀1.25 g·(500 ml)－1，37%甲醛100 μl］中染色20 min，漂洗，顯色3～5 min，終止顯影10 min。

1.2.4 凝膠圖像掃描及分析 銀染顯色后的凝膠用Image scanner TM掃描儀進行透射掃描，獲得的數(shù)字化圖像運用ImageMasterR 2D Elite(Version 2.00)軟件進行蛋白質點的檢測、量化、背景扣除、點的匹配(Match)。在兩組圖譜中蛋白質的表達量相差兩倍的點被視為有差異的點，隨機選取重復性和分辨率較高的10個差異蛋白質點進行后續(xù)質譜分析鑒定。

1.2.5 差異蛋白點的質譜分析 從凝膠中挖取差異蛋白點，50%乙腈和50 mmol·L－1碳酸氫氨脫色30 min，脫水冷凍抽干，再加入5 ng·μl－1序列修飾后胰酶，4℃放置30 min，加入25 mmol·L－1碳酸氫氨7.5 μl，37 ℃放置12 h，加入0.35 μl 2%TFA終止酶解反應。將樣品和基質按1∶1等體積混合后吸取1 μl點樣于點樣靶上，干燥晾干后行MALDI－TOF－MS鑒定分析，在延遲解吸和反射模式下進行譜圖采集，激光波長337 nm，加速電壓設置19 kV。每一個肽譜圖大約是由200次轟擊壘加而成，外標采用布魯克公司肽混合物標準品，內標采用胰蛋白酶的自切峰，分別為 m/z 842.50和 m/z 2211.10，最終獲得肽質量指紋圖譜(PMF)。

1.2.6 蛋白質數(shù)據(jù)庫查詢 將PMF結果利用Mascot搜索引擎檢索蛋白質數(shù)據(jù)庫，將實驗得到的PMF和蛋白數(shù)據(jù)庫中理論的PMF加以比較即可鑒定蛋白質。檢索條件:蛋白質數(shù)據(jù)庫選擇SwissProt庫，物種來源選擇人類，酶選擇Trypsin，允許不完全的酶解片段選擇為1個，肽片段分子量最大允許誤差為50 ppm，離子選擇為MH+。

2 結 果

2.1 雙向凝膠電泳結果

在相同條件下對L3.6 pl細胞和Colo－357細胞的分泌蛋白質分別進行了3次雙向凝膠電泳分離，硝酸銀染色顯色后得到2－DE圖譜各3張，兩株細胞分泌蛋白質的圖譜分布模式非常相似。經(jīng)Image masterR 2D Elite(Version 2.00)軟件分析，L3.6 pl細胞分泌蛋白質的3張凝膠平均檢測到(840±20)個蛋白質點，Colo－357細胞分泌蛋白質的3張凝膠平均檢測到(860±25)個蛋白質點，兩組凝膠的匹配率為92%，將其中一塊凝膠設定為參考膠，進行3塊膠間的匹配分析得到平均匹配率分別為85.5%和88.6%。L3.6 pl和Colo－357細胞分泌蛋白質表達變化差異大于2倍的蛋白質點共20個，其中在L3.6 pl中上調表達蛋白11個，下調表達蛋白9個。由此，本實驗獲得了重復性、對比性均較好的L3.6 pl細胞和Colo－357細胞的分泌蛋白質的2－DE圖譜。見圖1、2。

圖1 人胰腺癌細胞L3.6 pl和Colo-357分泌蛋白質雙向凝膠電泳圖譜(圖中數(shù)字標識的是兩株細胞間差異表達的蛋白質點)Fig 1 Representative 2-DE map of secretome of pancreatic cell lines L3.6 pl and Colo-357(the differentially expressed protein spots between L3.6 pl and Colo-357 were labelled with figures)

圖2 部分差異表達蛋白質點的局部放大圖Fig 2 Close-up image of partial differential expression protein spots between L3.6 pl and Colo-357 spot1 and spot2 were significantly higher in L3.6 pl than those in Colo－357，and spot4 was significantly lower in L3.6 pl than that in Colo－357

2.2 差異表達蛋白質點的質譜鑒定

從2－DE膠中挑選背景清晰、分辨率和重復性較好的10 個差異蛋白點(1、2、3、4、5、6、7、8、9、13、20 號點)，行MALDI－TOF－MS鑒定分析，本研究共成功鑒定出其中5個蛋白質點，分別為:1號點，組織蛋白酶D前體(Cathepsin D precursor);2號點，表皮型脂肪酸結合蛋白(epidermal－Fatty acid－binding protein，E－FABP);4 號點，視黃醛脫氫酶1(retinal dehydrogenase 1);5號點，二磷酸核苷激酶B(nucleoside diphosphate kinase B);6號點，膜連蛋白A1(annexin A1)。其中，組織蛋白酶D前體、表皮型脂肪酸結合蛋白在高肝轉移潛能細胞株L3.6 pl中的表達水平高于低肝轉移潛能細胞株Colo－357，而視黃醛脫氫酶1、二磷酸核苷激酶B、膜連蛋白A1在L3.6 pl細胞株中的表達水平低于Colo－357細胞株。1號蛋白點質譜鑒定結果見圖3，得到鑒定的5個蛋白質點在雙向凝膠上的位置和具體信息分別見圖1和表1。

圖3 1號蛋白質點的MALDI-TOF-MS質譜鑒定結果Fig 3 MALDI-TOF-MS analysis of protein spot 1 A.Peptide mass fingerprinting of protein spot 1;B.Database query results of spot 1，which was identified as Cathepsin D precursor with a Mascot score of 136

表1 質譜鑒定的L3.6 pl和Colo-357細胞的差異分泌蛋白質Tab 1 List of differentially expressed secretory protein spots of pancreatic cell lines L3.6 pl and Colo-357 identified by MALDI-TOF-MS

3 討 論

分泌蛋白質可通過參與調控腫瘤細胞增殖、能量代謝、細胞運動、黏附及遷移、基質降解、血管生成等環(huán)節(jié)來影響腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。本研究采用比較蛋白組學的研究方法，對一對來自同一親本、具有不同肝轉移潛能的人胰腺癌細胞株L3.6 pl和Colo－357的分泌蛋白質進行分離、比較、篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)兩者之間有20種分泌蛋白質的表達水平發(fā)生了明顯改變，提示這些差異表達的分泌蛋白質可能與胰腺癌肝轉移密切相關，胰腺癌肝侵襲轉移的特性可能是眾多蛋白共同作用的結果。本研究最終鑒定出其中5種與胰腺癌肝轉移相關的分泌蛋白質，分別為組織蛋白酶D前體、表皮型脂肪酸結合蛋白、視黃醛脫氫酶1、二磷酸核苷激酶B、膜連蛋白A1。通過參考蛋白質數(shù)據(jù)庫信息及檢索相關文獻發(fā)現(xiàn)，此5種候選差異蛋白質可能通過調控胰腺癌細胞的生長、增殖、黏附、運動、凋亡等功能來影響胰腺癌肝轉移的病理進程。

組織蛋白酶D是一種天門冬氨酸肽鏈內切酶，其可以多種形式存在，分泌時為52 kU酶原，可自身降解為兩條肽鏈組成的48 kU活性分子中間體，中間體進一步加工修飾為34 kU及14 kU的肽鏈片段為其成熟形式。組織蛋白酶D在惡性腫瘤中的侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用，其通過降解細胞外基質和基底膜，并激活其他組織蛋白酶B(CB)及膠原酶，繼而觸發(fā)鏈式反應并最終促進腫瘤的浸潤和轉移［5］。組織蛋白酶D在某些腫瘤細胞中以無活性的前體形式存在。研究結果表明，這些無活性的前體在包括乳腺癌在內的許多腫瘤的增殖和轉移過程中發(fā)揮重要作用［5－8］，在本研究中組織蛋白酶D前體在高肝轉移潛能胰腺癌細胞株L3.6 pl中上調表達，提示組織蛋白酶D前體可能與胰腺癌肝轉移密切相關。

E－FABP屬于脂質結合蛋白超家族成員，是一種對脂肪酸有高親和力的小分子量的可溶性蛋白質，廣泛存在于哺乳動物組織和細胞中，主要在脂肪酸的攝取、轉運及代謝調節(jié)中發(fā)揮作用。近來研究發(fā)現(xiàn)EFABP在胰腺癌［9］和結腸癌［10］的耐藥細胞株中均呈過度表達，提示其可能與腫瘤的生長密切相關。進一步研究證實，E－FABP是癌基因c－myc的靶基因，并可被腫瘤相關抗原EpCAM誘導后快速上調表達［11］，c－myc和EpCAM可能作為E－FABP的上游因子，在特定階段開啟和關閉E－FABP的表達，調節(jié)腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移。然而，目前對E－FABP在腫瘤侵襲轉移中的作用尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)，E－FABP在高肝轉移潛能胰腺癌細胞株L3.6 pl分泌蛋白質中呈顯著上調表達，提示其可能促進胰腺癌肝轉移，而Uma等［12］研究表明舌鱗狀細胞癌細胞的頸部淋巴結轉移潛能與其E－FABP的表達水平則呈負相關關系。關于E－FABP在胰腺癌肝轉移中的作用機制尚待進一步探討研究。

二磷酸核苷激酶B是nm23基因編碼的產(chǎn)物，nm23基因家族是一類與腫瘤細胞轉移潛能有關的腫瘤轉移抑制基因，其表達與腫瘤轉移呈負相關，對腫瘤轉移起抑制作用，其主要通過參與微觀蛋白的聚合和調節(jié)G蛋白介導的信號傳遞，從而發(fā)揮對腫瘤細胞增殖、遷移的負性調節(jié)來實現(xiàn)抑制腫瘤轉移的作用［13］，本研究發(fā)現(xiàn)二磷酸核苷激酶B在高肝轉移L3.6 pl細胞分泌蛋白質中的表達水平顯著低于低肝轉移Colo－357細胞，提示二磷酸核苷激酶B可能作為胰腺癌肝轉移的負性調節(jié)因子發(fā)揮抑制胰腺癌肝轉移的作用。

本研究將雙向凝膠電泳、質譜分析等蛋白質組學技術引入胰腺癌定向肝轉移方面的研究中，篩選出了部分胰腺癌肝轉移相關分泌蛋白，這些蛋白涉及腫瘤細胞的生長、增殖、黏附、運動、凋亡等功能相關事件，但由于蛋白組學技術本身存在的局限性，本研究結果尚需進一步的驗證，以證實這些差異表達的蛋白質在胰腺癌肝轉移中的作用。

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