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    丙型肝炎免疫層析診斷試劑研制和性能分析

    2010-12-23 04:50:46蔣樹(shù)海楊發(fā)青TonyLee王朝南孫樹(shù)葉王之?huà)?/span>
    中國(guó)醫(yī)藥指南 2010年24期
    關(guān)鍵詞:包被膠體金試劑

    蔣樹(shù)海 楊發(fā)青 Tony Lee 王朝南 孫樹(shù)葉 田 輝 王之?huà)?

    全球約1.7億人感染丙型肝炎病毒(HCV),危害十分嚴(yán)重[1]。我國(guó)HCV的感染率約為3.2%,HCV抗體攜帶者達(dá)4千萬(wàn)[2]。我國(guó)將HCV抗體檢查列為我國(guó)法定的血源性篩查項(xiàng)目。當(dāng)前最為常用的HCV抗體檢測(cè)方法是ELISA法,將C22-3、C33C、C100-3和NS5作為包被抗原,標(biāo)記抗人IgG進(jìn)行檢測(cè)[3]。免疫膠體金技術(shù)是新型的免疫學(xué)檢測(cè)方法,具有檢測(cè)簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn),但運(yùn)用免疫層析技術(shù)對(duì)HCV抗體檢測(cè)具有一定的技術(shù)難度。本文報(bào)道一種以雙抗原夾心膠體金法研制HCV抗體診斷試劑盒的方法,及其對(duì)臨床性能分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑 HCV抗原:為HCV NS3、Core融合抗原,來(lái)自美國(guó)和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,用于試劑的包被和標(biāo)記;氯金酸BSA,PEG20000,水解酪蛋白:Sigma試劑:Sigma試劑,NC膜:Millipore公司。其他常用試劑均為分析純?cè)噭?/p>

    1.1.2 干擾樣本

    包括高血脂、溶血、黃疸血清,含抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿,含相關(guān)傳染病抗體陽(yáng)性血清,由本公司在相關(guān)醫(yī)院收集、驗(yàn)證并保存,HCV抗體陰性。1.1.2 HCV抗體國(guó)家血清盤(pán)中國(guó)藥品生物制品檢定所研制。

    1.1.4 HCV抗體ELISA試劑盒

    1.1.5 臨床樣本 共581例,由中國(guó)藥品生物制品檢定所收集,為獻(xiàn)血員和HCV患者樣本。

    1.2 方法

    1.2.2 HCV重組抗原的包被

    用0.01mol/L pH7.2 PBS將HCV重組抗原稀釋成適當(dāng)適當(dāng)濃度,噴膜包被,包被完成后將NC膜在干燥間干燥6~8h,備用。

    1.2.1 HCV重組抗原的膠體金標(biāo)記

    以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,用K2CO3將溶液調(diào)到pH 8.0。按每1mL溶液加入10μg重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中,繼續(xù)攪拌1h,再以BSA和PEG20000進(jìn)行封閉,離心,棄上清,沉淀按原體積復(fù)溶至膠體金稀釋液中。然后將標(biāo)記膠體金溶液涂抹在無(wú)紡布載體上,制成膠體金墊。按同樣方法標(biāo)記鼠IgG,制備的鼠IgG膠體金墊用于試劑質(zhì)控。

    1.2.3 試紙組裝

    在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、PVC板、上樣墊、在PVC板帖包被好的NC膜,NC膜下緣粘貼膠體金墊,膠體金墊下緣粘貼上樣墊,NC膜上緣粘貼吸水濾紙,再切成4mm寬的試紙條。密封于鋁箔袋中,組裝成成品。

    1.2.4 性能分析評(píng)估

    建筑勞務(wù)企業(yè)作為推動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱之一,理所當(dāng)然應(yīng)當(dāng)受到國(guó)家的高度重視。為了推動(dòng)建筑勞務(wù)企業(yè)的發(fā)展,國(guó)家應(yīng)當(dāng)緊跟時(shí)代步伐,不斷完善建筑相關(guān)的法律法規(guī),從而規(guī)范建筑勞務(wù)企業(yè)可能出現(xiàn)的種種不良行為,并為他們提供相應(yīng)的發(fā)展方向。建筑勞務(wù)企業(yè)也應(yīng)當(dāng)在滿足法律法規(guī)的前提下,制定符合自身發(fā)展需要的內(nèi)部規(guī)章制度,從而為自身的發(fā)展提供制度保障。建筑勞務(wù)企業(yè)可以建立內(nèi)部激勵(lì)機(jī)制、質(zhì)量保障機(jī)制以及實(shí)名制管理等,這些制度的建立都能夠有效提高工作效率以及工作質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)自身的可持續(xù)發(fā)展。

    將公司保存的含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿,高血脂、溶血、黃疸血清;關(guān)傳染病HAV、HIV、HBV、HP和TP抗體陽(yáng)性血清取出,用試劑進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.5 穩(wěn)定性分析

    ①將快速診斷試劑置于37℃、50℃條件下,每隔7d取出部試劑,進(jìn)行測(cè)試。②將快速診斷試劑在室溫條件下保存。③在實(shí)際保存狀態(tài)下每天至6個(gè)月取出試劑,進(jìn)行測(cè)試。

    1.2.6 國(guó)家參考品血清盤(pán)的檢測(cè)

    取出HCV抗體國(guó)家參考品,平衡到室溫后,將快速診斷試劑條平放,在上樣墊上滴加50~100μL被檢測(cè)樣品,在30min根據(jù)檢測(cè)線是否出現(xiàn)判定結(jié)果。

    1.2.7 臨床樣本分析

    581份臨床樣本同時(shí)用Ortho、Murex和Sorin 3種ELISA試劑和快速診斷試劑進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算并統(tǒng)計(jì)本試劑的臨床性能。

    2 結(jié) 果

    2.1 分析特性能

    檢測(cè)結(jié)果試劑對(duì)高血脂、溶血、黃疸血清檢測(cè)均為陰性;HAV、HBV、HIV、TP和HP抗體陽(yáng)性樣本;不同抗凝劑測(cè)均為陰性,對(duì)以上物質(zhì)沒(méi)有非特異性反應(yīng)。

    2.2 穩(wěn)定性分析

    在室溫條件下,6、9、12、18個(gè)月檢測(cè)均能通過(guò)HCV國(guó)家血清盤(pán)測(cè)試。37℃條件共檢測(cè)到6周,50℃條件下共檢測(cè)到3周,均能通過(guò)HCV國(guó)家血清盤(pán)測(cè)試。根據(jù)加速破壞試驗(yàn)結(jié)果,快速診斷試劑的穩(wěn)定性較好,室溫條件下穩(wěn)定性達(dá)到18個(gè)月。

    2.3 國(guó)家血清盤(pán)檢測(cè)

    以國(guó)家參考品作為樣品進(jìn)行測(cè)試,檢測(cè)結(jié)果和規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)完全一致,并且敏感度樣本全部檢出,見(jiàn)表1。

    2.4 對(duì)臨床樣本分析

    表1 快速診斷試劑對(duì)HCV抗體國(guó)家血清盤(pán)測(cè)試

    對(duì)581份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè),均檢測(cè)出樣本中有300份以上的HCV抗體陽(yáng)性樣本,但并不完全一致,見(jiàn)表2。

    表2 4種試劑對(duì)臨床樣本HCV抗體的檢測(cè)結(jié)果

    3種試劑間共有61份樣本存在部分檢測(cè)結(jié)果不一致現(xiàn)象,相互間的符合率為91%至96%。

    由于單個(gè)試劑可能存在一定的假陽(yáng)性和假陰性,以3種ELISA試劑中的2種檢測(cè)一致結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)分析更能反應(yīng)樣本的真實(shí)情況,對(duì)比分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下,見(jiàn)表3。

    表3 2種ELISA試劑一致檢測(cè)結(jié)果和本試劑對(duì)比分析結(jié)果

    3 討 論

    HCV抗體檢測(cè)一直存在難度,需要檢測(cè)抗多種抗體聯(lián)合包被以提高檢測(cè)的敏感度[4]。多種診斷用抗原增加了試劑研制的復(fù)雜性,對(duì)于HCV抗體快速診斷試劑成功的研究報(bào)道有限。HCV抗體診斷ELISA試劑由于的Core抗原的特殊性,雖然已發(fā)展到第3代,但一直采用間接法進(jìn)行檢測(cè)。由于蛋白和膠體金的標(biāo)記為物理吸附[5],所以抗原可能和膠體金標(biāo)記并保持其活性,實(shí)現(xiàn)雙抗原夾心法快速檢測(cè)。雙抗原夾心法存在兩次特異性抗原-抗體的結(jié)合,同時(shí)雙抗原夾心法能檢測(cè)出樣本中IgM,亦能增加檢測(cè)的敏感度,特別對(duì)于HCV,IgM經(jīng)常出現(xiàn)[6]。

    本研究采用了雙抗原夾心法對(duì)HCV抗體進(jìn)行檢測(cè)。研究過(guò)程中經(jīng)不斷試驗(yàn)和優(yōu)休。對(duì)國(guó)內(nèi)外數(shù)個(gè)不同來(lái)源抗原進(jìn)行篩選,最后得到了理想的抗原和工藝技術(shù),研制出理想的試劑,性能穩(wěn)定性良好。臨床樣本分析表明,和高質(zhì)量ELISA相比,陰性符合率為97.4%,陽(yáng)性符合率為96.5%,說(shuō)明研制的快速診斷試劑和ELISA無(wú)顯著性差異,性能相似。由于免疫快速診斷試劑具有穩(wěn)定性好檢測(cè)方便、快速等特點(diǎn),高性能的HCV抗體免疫快速檢測(cè)試劑和ELISA試劑互補(bǔ),能在臨床上特別是中小醫(yī)院得到廣泛運(yùn)用,輔助診斷丙型肝炎,具有重要的社會(huì)意義。

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    [2] 彭劼.慢性丙型肝炎的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2008,37(3):5-7.

    [3] Roggendorf M,Lu M,Meisel H,et al.Rational use of diagnostic tools in hepatitis C [J].Hepatol.1996,24(2 Suppl):26-34.

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