胰酶水解豬皮膠原蛋白及其產(chǎn)物氨基酸分析

胥彩云，童軍茂，周曉宏

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100081）

胰酶水解豬皮膠原蛋白及其產(chǎn)物氨基酸分析

胥彩云1，童軍茂1，周曉宏2,*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.北京理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100081）

采用胰酶水解豬皮膠原蛋白，研究其降解規(guī)律及酶解產(chǎn)物氨基酸組成。研究表明：95℃熱處理豬皮膠原蛋白10 min能顯著提高酶解速率；整個酶解過程中，可溶性氮、氨肽氮含量呈增加趨勢，但3h后增勢變緩，而肽含量在3h后達(dá)到最大值；大部分不溶性蛋白在酶解6 h后已經(jīng)變成可溶性多肽和氨基酸；從酶解產(chǎn)物氨基酸組成可表明，采用胰酶水解豬皮膠原蛋白能顯著提高其營養(yǎng)價(jià)值。

豬皮膠原蛋白；熱變性；酶解；氨基酸分析

動物皮膚最重要的一個應(yīng)用就是制革，但是由于豬皮本身的質(zhì)地不佳，目前在皮革工業(yè)中已經(jīng)很少采用豬皮，發(fā)展豬皮深加工是豬皮加工業(yè)的必然趨勢。豬皮中約含水分70%～75%[1]，蛋白質(zhì)21%～23%，脂肪1%，灰分0.5%。豬皮中的蛋白質(zhì)以膠原蛋白為主，含量為87.7%。膠原蛋白具有獨(dú)特的三股超螺旋結(jié)構(gòu)，三條鏈相互平行而且由鏈間氫鍵相連[2]，具有十分穩(wěn)定的性質(zhì)，一般的加工溫度及短時間加熱都難使其分解，因此難被人體吸收，食用利用率較低[3]，將膠原蛋白水解為多肽后，其營養(yǎng)及生理功能可顯著提高：蛋白質(zhì)消化吸收率幾乎達(dá)100%，能保護(hù)胃黏膜以及抗?jié)?，促進(jìn)皮膚膠原代謝，抑制血壓上升，對關(guān)節(jié)炎等膠原病具有很好的預(yù)防及治療作用，能促進(jìn)鈣吸收和降低血清中膽固醇含量等[4-6]。膠原蛋白的水解及膠原多肽的利用一直是科學(xué)工作者研究的一個熱門課題。因此，利用酶技術(shù)處理豬皮制備膠原蛋白是提高其資源利用率和附加值的有效途徑。目前對豬皮酶水解的研究集中在水解工藝條件的摸索方面，班玉鳳等[7]確定了Alcalase對豬皮膠原蛋白水解的最優(yōu)條件，王川，李燕等研究了用胰酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶從豬皮中提取膠原蛋白，其中以胰酶提取物得率最高，但結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重，用胃蛋白酶提取的膠原蛋白制品的結(jié)構(gòu)最完整，色澤最為潔白，但得率最低[8]。本文采用胰酶氮存在形式、肽分子量分布變化規(guī)律以及水解產(chǎn)物的氨基酸組成，為酶技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)具高附加值的豬皮深加工制品(如復(fù)合氨基酸和活性肽等)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豬皮購于北京市中關(guān)村家樂福超市（凍藏）刮脂、洗凈、繳碎，裝袋，置于-18℃冰箱中冷凍，試驗(yàn)前從冰箱中取出在流動的自來水中緩化解凍，備用。

胰酶（Trypsin-chymotrypsin）由丹麥NOVO公司提供。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

MM12型絞肉機(jī)：廣東省韶關(guān)市食品機(jī)械廠；CU600型電熱恒溫水箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KDN-2C型定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2000型分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司。

試驗(yàn)中所采用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 分析方法

氨態(tài)氮含量：水解液中游離氨基酸含量占原料中總蛋白質(zhì)含量百分比，采用甲醛電位滴定法[9]分析；可溶性氮含量：水解液中蛋白質(zhì)含量占原料中總蛋白質(zhì)含量百分比，采用微量凱氏定氮法分析；肽基氮含量：水解液中肽含量占原料中總蛋白質(zhì)含量百分比，即可溶性氮含量與氨基氮含量之差；氨基酸組成分析：日立835-50型氨基酸自動分析儀。

1.4 豬皮水解工藝

酶作用條件采用前期正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果。取解凍后豬皮50 g，加100 g蒸餾水勻漿1 min，調(diào)節(jié)初始pH至8.5，升溫至37℃，加入0.3 g胰酶，于水浴上恒溫?cái)嚢璺謩e水解 2、4、6 、8、10 、12 h 。酶解完畢，將酶解液于沸水浴中滅酶 20 min，離心（4800 r/min，20 min）過濾，所得濾液為酶解產(chǎn)物。其中未水解樣為豬皮勻漿后直接離心過濾的濾液部分，即豬皮水溶性提取物。所有樣品均稀釋至240 g用于分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱處理對胰酶水解豬皮膠原蛋白的影響

分別取豬皮50 g，加入100 g水勻漿1 min，分別于溫度為 70、80、90、100 ℃水浴中保溫 10 min，然后按照1.4工藝水解2 h。不同溫度處理后豬皮膠原蛋白胰酶水解產(chǎn)物中氨態(tài)氮、可溶性氮以及肽基氮含量見圖1。

由圖1可以看出，水解時間相同時，隨著熱處理溫度的增加，豬皮膠原蛋白胰酶酶解產(chǎn)物中可溶性氮、氨基氮含量呈增高趨勢，即熱變性溫度越高，豬皮膠原蛋白消化率越高，70℃以后，這種趨勢更加明顯。膠原蛋白的分子量約為300000～360000，它是由3條肽鏈盤繞而成的三股螺旋結(jié)構(gòu)[10]，但熱處理使三股螺旋解旋而成游離多肽鏈，破壞分子間的共價(jià)交聯(lián)，引起膠原中鍵的隨機(jī)水解，變成大分子明膠，肖和蘭等[11]運(yùn)用傅里葉紅外光譜法（FTIR）和二維相關(guān)分析（2D correlation analysis）技術(shù)研究也發(fā)現(xiàn)，在15℃～95℃升溫過程中，膠原的3條螺旋肽鏈之間的氫鍵減弱，逐漸解螺旋，每條肽鏈因伸直而使其螺旋度減少，整個蛋白的變化能微擾并引起膠原蛋白結(jié)構(gòu)的變化。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)論一致，原蛋白質(zhì)分子致密的立體結(jié)構(gòu)有礙于蛋白酶與底物的結(jié)合，熱處理使其成為松散的結(jié)構(gòu)，暴露原來包埋于內(nèi)部的作用位點(diǎn)，從而加速了水解速率。

圖1 不同熱處理溫度對豬皮膠原蛋白Trypsin-chymotrypsin酶解產(chǎn)物中氮存在形式影響Fig.1 Effects of different temperatures on N-forms in Pigskin collagen-Trypsin-chymotrypsin hydrolysates

2.2 胰酶水解豬皮膠原蛋白過程中氮存在形式變化規(guī)律

由圖1可知，在90℃～100℃之間加熱預(yù)處理可加速胰酶對豬皮膠原蛋白的水解速率，所以采用胰酶水解豬皮膠原蛋白時先于95℃處理底物10 min。再將豬皮勻漿按照酶解工藝水解不同時間，其產(chǎn)物中氨態(tài)氮、可溶性氮以及肽基氮含量見圖2。

圖2 胰酶水解豬皮膠原蛋白過程中氮形式變化Fig.2 Changes of N-forms during hydrolysis of Pigskin collagen by Trypsin-chymotrypsin

由圖2可以看出，隨著酶解時間的延長，水解產(chǎn)物中可溶性氮、游離氨基酸含量不斷地增加，且都在水解3h內(nèi)增速最快，隨后增勢變緩；而肽含量也是在水解3h內(nèi)增速最快，這表明這段時間胰酶主要以豬皮膠原蛋白為底物，酶解3h時肽含量達(dá)到最大值，隨后下降，這是由于酶解過程中同時存在著豬皮膠原蛋白降解成肽和氨基酸以及這些肽被進(jìn)一步降解成更小分子量的肽和氨基酸兩個過程，這兩個過程在酶解過程中某一時間段孰占優(yōu)勢對產(chǎn)物中肽的含量有直接的影響，酶解后期，胰酶主要以產(chǎn)物中存在的肽為底物，釋放出更小分子量的肽和氨基酸，因此肽的含量表現(xiàn)出下降趨勢。

2.3 胰酶水解豬皮膠原蛋白產(chǎn)物氨基酸分析

一般蛋白質(zhì)含有20種氨基酸，膠原含有18種氨基酸[12-13]，有其特別的組成。由表1可見膠原的氨基酸組成的一些特點(diǎn)。

表1 膠原蛋白水解時間對氨基酸含量的影響Table 1 Comparison of amino acid composition in collagen-Trypsin-chymotrypsin hydrolysates at various hydrolysis time%

絕大多數(shù)蛋白質(zhì)中脯氨酸含量很少，而膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸的含量是各種蛋白質(zhì)中最高的，這兩種氨基酸都是環(huán)狀氨基酸，鎖住了整個膠原分子，使之很難拉開，故膠原具有微彈性和很強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度。

膠原中缺少胱氨酸和色氨酸，只說明膠原是一種不完全蛋白。從營養(yǎng)學(xué)意義上講，膠原是一種硬蛋白，3條肽鏈之間鍵合牢固，人和動物很難消化吸收，因此將膠原蛋白酶法水解后，將膠原的3條肽鏈拆開，成為游離的多肽，進(jìn)而逐步水解成為小肽和游離的氨基酸，消化吸收率大大提高。

可見，豬皮膠原蛋白經(jīng)胰酶水解處理后能顯著提高其營養(yǎng)價(jià)值。

3 結(jié)論

胰酶水解豬皮膠原蛋白研究表明：熱處理豬皮膠原蛋白大大提高酶解速率：熱處理后，酶解液中可溶性氮含量由63.5%增加至87.9%；氨態(tài)氮含量由10.8%增加至37.9%。在整個酶解過程中，可溶性氮、游離氨基酸含量呈增加趨勢，前3h內(nèi)增勢較快，但3h后增勢緩慢，而肽含量在水解3h達(dá)到最大值48.1%。大部分不溶性蛋白在酶解4 h后已經(jīng)變?yōu)榭扇苄远嚯暮桶被?，蛋白質(zhì)的溶解過程基本結(jié)束。酶解12 h～48 h各時間段酶解產(chǎn)物中18種氨基酸含量略有變化，但氨基酸種類無變化。表明采用胰酶水解豬皮膠原蛋白能顯著提高其營養(yǎng)價(jià)值。豬皮膠原蛋白胰酶水解產(chǎn)物中各肽段的具體生理活性、功能性有待進(jìn)一步研究。

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Trypsin Hydrolysis Pigskin Collagen and its Amino Acid Analysis

XU Cai-yun1,TONG Jun-mao1,ZHOU Xiao-hong2,*

（1.College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang,China；2.School of Life Science and Technology,Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Pigskin collagen was hydrolyzed by Trypsin-chy motry psin to explore the degrading pattern and the amino acid composition of the resultinghydrolysate.The results showed that heat Pigskin collagen 10 min at 95℃was advantageous to enzymatichydrolysis of Pigskin collagen.Content of soluble nitrogen and amino nitrogen kept on increasing during hydrolysis,but increased slowly after 3h hydrolysis.Peptide content reached a maximum after 3h hydrolysis.A majority of unsoluble protein and peptides were degraded into soluble peptidesand amino acids after 6 h hydrolysis,acid composition in Pigskin collagen hydrolysate suggested that Pigskin collagen hydrolyzed by Trypsin-chymotrypsin improved the nutritional value of Pigskin collagen greatly.

pigskin collagen；heat denaturation；enzymatic hydrolysis；aminoacidanalysis

胥彩云（1983—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者

2009-09-17