熒光圖像早期癌癥診斷儀的臨床應(yīng)用研究

【作 者】葉衍銘，蕭樹(shù)東，戈之諍，鄭家驃，夏敬芳，姜智敏

上海市消化疾病研究所內(nèi)鏡熒光圖像研究課題組，上海市，200001

我國(guó)衛(wèi)生部在頒發(fā)的2004年到2010年的《中國(guó)癌癥預(yù)防與控制規(guī)劃綱要》中指出，中國(guó)的癌癥危害已經(jīng)日益嚴(yán)重。癌癥是以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的一大類(lèi)疾病，它的發(fā)病原因與有害環(huán)境、不良的生活方式及遺傳易感性等都有很大的關(guān)系。2000年全球新發(fā)的癌癥病例約有1000萬(wàn)，死亡620萬(wàn)，現(xiàn)患病例2200萬(wàn)。預(yù)計(jì)到2010年癌癥新發(fā)病例將達(dá)到1500萬(wàn)，死亡1000萬(wàn)，現(xiàn)患病例3000萬(wàn)。癌癥正在成為人類(lèi)的第一殺手，是一種死亡率很高的疾病，大多數(shù)癌癥患者存在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高和預(yù)后差的情況。根據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)告，5年生存率僅在10～30%。大量臨床病例證明，癌癥的早期診斷、早期治療，其徹底治愈可以達(dá)到90%左右。其治療生存率低的原因，正是癌癥早期診斷的困難所造成。隨著DR、CT、MRI、CT-PET的普及應(yīng)用，越來(lái)越多的較小惡性腫瘤被較早期發(fā)現(xiàn)。但是，癌前病變，體積很小，形態(tài)特征不典型，甚至肉眼很難識(shí)別的惡性腫瘤，通常還是不能被識(shí)別。目前，世界上正興起熒光內(nèi)鏡早期癌癥診斷系統(tǒng)的研究，有望成為解決以上不足的一種早期癌癥診斷新技術(shù)。

人體組織在短波長(zhǎng)光如紫外光、紫光和藍(lán)光等照射后，可以誘發(fā)組織內(nèi)許多熒光基團(tuán)和物質(zhì)，如膠原、強(qiáng)力蛋白、還原型煙酸胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、黃素膘嘌呤二核苷酸（FAD）亞鐵血紅素生成合成途中或細(xì)胞感染產(chǎn)生的卟啉等產(chǎn)生不同顏色的熒光，這稱(chēng)之為人體組織的自體熒光。由于人體組織層次結(jié)構(gòu)復(fù)雜，各類(lèi)內(nèi)源性熒光分布廣，因此所產(chǎn)生的組織熒光光譜波段很寬，分布在450～750 nm范圍內(nèi)[1-3]。而來(lái)自于粘膜下層的正常胃腸道組織的自體熒光光譜表現(xiàn)為明顯的綠色特征的光譜，如圖1中A所示，熒光光譜峰在500-510 nm。胃腸道組織癌變或發(fā)生癌前早期癌變后，因癌癥組織形態(tài)異常和內(nèi)源性熒光物質(zhì)變化的共同作用的結(jié)果，使其光譜則以綠色熒光減弱和紅光熒光增強(qiáng)為主要特征，如圖1中B所示，與正常胃腸道組織的熒光光譜有著明顯差別。

圖1 熒光波長(zhǎng)（nm）Fig.1 Autofl uorescence spectrum

自20世紀(jì)80年代，蕭樹(shù)東、Cathren等[4-5]報(bào)道應(yīng)用激光誘發(fā)自體熒光光譜（LIFS）臨床檢測(cè)胃癌和結(jié)腸腺瘤以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究[6-8]表明，LIFS對(duì)胃腸道早期腫瘤和癌前病變的診斷具有很高的敏感性和特異性，可為胃腸道病變?cè)\斷提供更多有關(guān)形態(tài)改變和生化異常的補(bǔ)充信息。LIFS的最大的缺陷在于僅能對(duì)組織進(jìn)行單一點(diǎn)的檢查，每次檢測(cè)的胃腸道粘膜的面積僅為2～4 mm2，獲得信息缺乏組織連貫性，不可避免存在取樣誤差，影響了LIFS的診斷準(zhǔn)確率[9]，限制了其在臨床中應(yīng)用。

圖2 熒光圖像早期癌癥診斷儀在胃癌診斷中應(yīng)用示意圖Fig.2 Light-Tnduced fl uorescence endoscopy used in gastric cancer diagnosed

熒光圖像內(nèi)鏡成像LIFE系統(tǒng)所具有的組織檢查的連貫性、大面積、快速、實(shí)時(shí)的自體熒光檢測(cè)的新技術(shù)被極大關(guān)注，成了近年來(lái)早期癌癥和癌前病變?cè)\斷研究的主攻方向[10]。熒光圖像內(nèi)鏡成像系統(tǒng)多數(shù)是采用癌癥熒光光譜特征中比值的識(shí)別技術(shù)，我們研制的熒光圖像早期癌癥診斷儀（圖2）正是利用這一原理制作而成，在我們的系統(tǒng)中采用藍(lán)紫色激光進(jìn)行激發(fā)，在高靈敏CCD前分別用透過(guò)綠光（490-570 nm）和透過(guò)紅光（625-690 nm）濾色片記錄下的紅色和綠色圖像，然后，將這二幅圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，計(jì)算出這二幅圖像所對(duì)應(yīng)各點(diǎn)的 R（紅光）和 G（綠光）的熒光比值后，得到一幅以R（紅光）/G（綠光）比值大小分布的數(shù)字圖像，然后將這數(shù)字圖像用加權(quán)辦法，根據(jù)R/G（癌）＞R/G（正常）的原則，采用某一光譜比值R/G的數(shù)值為惡變的閾值（設(shè)定為F）為判斷依據(jù)，把癌變組織部位R/G＞F地方顯示為紅色、正常組織部位R/G＜F的地方顯示為綠色，這樣就形成一幅用于診斷的癌變部位顯示紅色而正常部位為綠色的假彩色圖像。從這幅假彩色的圖像中，根據(jù)不同的顏色很容易把癌變的部位與正常部位區(qū)分開(kāi)來(lái)，達(dá)到診斷的目的。在我們的裝置中除了藍(lán)紫色激光照明外，還加上白光照明，并采用先進(jìn)的兩光源快速切換、雙通道圖像同步跟蹤讀取技術(shù)，使之能在同一時(shí)段里獲得檢測(cè)位置的真彩色圖像和熒光假彩色診斷圖像進(jìn)行實(shí)時(shí)的同屏顯示，如圖3和圖4所示。

圖3 胃癌病灶部的圖像Fig.3 Gastric cancer image

圖4 正常胃粘膜的圖像Fig.4 Nomal mucosal image

從這些實(shí)時(shí)、快速同屏顯示的真彩色圖像與熒光假彩色圖像的對(duì)照中，使癌變的部位和范圍都一目了然地表示出來(lái)。熒光圖像（LIFE）成像診斷技術(shù)還可以克服熒光光譜（LIFS）技術(shù)所存在的觀察范圍小和檢測(cè)部位沒(méi)有組織連貫性的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在很短的時(shí)間內(nèi)掃描整個(gè)檢查部位，避免了熒光光譜（LIFS）所存在的取樣誤差，快速捕捉可疑病灶信息，精確引導(dǎo)活檢，為提高了早期癌癥的檢出率提供可靠的技術(shù)保障。

我們研制的熒光圖像早期癌癥診斷儀目前已進(jìn)入初步的臨床試驗(yàn)，進(jìn)行了離體105病例中的210個(gè)標(biāo)本的檢測(cè)。其中癌癥病灶標(biāo)本100個(gè)（胃癌61，食管癌15，直腸癌29）以及正常消化道粘膜組織和良性腫瘤標(biāo)本共110個(gè)。我們研制的熒光圖像早期癌癥診斷儀檢查結(jié)果與病理檢查的結(jié)果對(duì)照見(jiàn)表1所示。

表1 癌癥熒光圖像診斷與病理結(jié)果對(duì)照Tab.1 Light-induced fluorescence endoscopy diagnosed results

從以上初步研究結(jié)果表明，我們研制的系統(tǒng)對(duì)胃腸道癌癥診斷的敏感性、特異性、診斷率分別為94.0%、95.5%和94.8%，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

為了深入研究在我們系統(tǒng)中所采用的光譜比值大小作為癌癥存在與否的一個(gè)重要的指征及其應(yīng)用價(jià)值，我們對(duì)129例病人用藍(lán)紫色激光誘發(fā)的熒光光譜（LIFS）的測(cè)量數(shù)據(jù)，用熒光圖像中所使用的條件做光譜比值的數(shù)值運(yùn)算，研究其中所展示的癌癥熒光特征的規(guī)律。具體是我們?cè)?29例病人（48例癌癥、81例正常）測(cè)了129條熒光光譜曲線(xiàn)后，按照熒光圖像使用的G（綠光）濾光（490-570 nm）波段與R（紅光）濾光（625-690 nm）波段的計(jì)算出R（紅光）/G（綠光）熒光強(qiáng)度的比值，以其大小順序排列并作圖（如圖5所示）。48例癌癥為圖5的A曲線(xiàn)分布，81例正常為圖5的B曲線(xiàn)分布。從這兩條曲線(xiàn)可以看出，癌癥的光譜R/G的比值集中在圖中R/G比值大的上方，正常部位的R/G比值卻集中在圖中R/G比值小的下方，從而得到下面這樣的規(guī)律：癌癥組織的R/G比值要大于正常組織的R/G比值，而且也進(jìn)一步證實(shí)熒光光譜比值的大小確實(shí)是研究腫瘤良惡性的一個(gè)重要指征。在此也與熒光圖像一樣，采用R/G比值的閾值F為判據(jù)的話(huà)，取閾值F=20，當(dāng)相于R/G比值為0.20,最后得到診斷的結(jié)果就像圖5中示意那樣：在48例癌癥中，43例為癌癥熒光特征（5例為假陰性）；81例正常中，75例為正常熒光特征（6例為假陽(yáng)性），其診斷敏感度、特異性、診斷率分別為87.8%、92.6%、90.7% 。

圖5 檢測(cè)病例的熒光比Fig.5 Fluorescence ratio map of diagnose case

從以上研究中可以看到：

（1） 我們的裝置是通過(guò)檢測(cè)紅光圖像和綠光圖像進(jìn)行圖像空間中各像點(diǎn)紅光強(qiáng)度與綠光強(qiáng)度之比大小的比較，采用其R/G比值中某一數(shù)值為閾值F來(lái)決定癌癥是否存在，即是R（紅光）/G（綠光）的比值大于F時(shí)表現(xiàn)為癌癥特征（紅色）圖像；而R（紅光）/G（綠光）的比值小于F時(shí)表現(xiàn)正常組織（綠色）圖像，閾值F大小是根據(jù)臨床具體情況進(jìn)行設(shè)定的。熒光圖像診斷中所采用的光譜比值閾值定則分析法是一種可量化、客觀和可靠的檢測(cè)方法，是熒光光譜研究成果在熒光圖像中的具體應(yīng)用。在熒光光譜測(cè)量像圖5中所展示的規(guī)律——癌癥組織的光譜比值大于正常組織的光譜比值，正是我們熒光圖像早期癌癥診斷儀的重要判定依據(jù)。

（2） 本文在臨床試驗(yàn)中所得到的結(jié)果與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究相當(dāng)接近[11-13]，揭示了誘發(fā)組織的自體的熒光圖像檢測(cè)是診斷癌癥和癌前病變的一個(gè)有效方法。本文所展示采用同一癌變的判定方法的二種檢測(cè)手段所得到的結(jié)果可以看到，熒光圖像（LIFE）檢測(cè)所得到的結(jié)果要好于熒光光譜（LIFS）。由此可以發(fā)現(xiàn)熒光圖像（LIFE）能做到在大范圍內(nèi)、快速同時(shí)探測(cè)到極多像點(diǎn)部位的熒光信息，避免了熒光光譜（LIFS）中存在的一次只檢測(cè)一點(diǎn)的所產(chǎn)生隨機(jī)測(cè)量誤差，因此可以得到更為滿(mǎn)意的結(jié)果，這正是熒光圖像（LIFE）具有更好的優(yōu)越性和實(shí)用性所在。

（3） 從我們臨床研究的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，癌組織和癌前病變組織中參與產(chǎn)生紅色熒光的熒光物質(zhì)是很少的，導(dǎo)致紅色熒光發(fā)射非常微弱，要探測(cè)這樣微弱的信息，必須采用超高靈敏的成像系統(tǒng)才能捕捉到這些微光圖像。系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)在高靈敏的條件下會(huì)帶來(lái)許多干擾，如靈敏度高的圖像探測(cè)器線(xiàn)性范圍自然就窄，非線(xiàn)性的影響會(huì)導(dǎo)致熒光光譜比值反常；靈敏度高其抗雜散光的能力就差，而反射光、散射光的干擾都會(huì)使測(cè)到的信息失去真實(shí)性等，都會(huì)嚴(yán)重影響診斷準(zhǔn)確性和可靠性。如何選好光譜濾色片加強(qiáng)對(duì)反射光、散射光有效的隔離；如何設(shè)定在線(xiàn)性區(qū)工作的實(shí)驗(yàn)條件以及進(jìn)行必要的非線(xiàn)性的補(bǔ)償，是我們課題所重點(diǎn)關(guān)注的與提高診斷率息息相關(guān)的重大問(wèn)題。

（4） 在臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)消化道正常粘膜以及一些良性腫瘤如多發(fā)性腺瘤、息肉等在探測(cè)時(shí)都顯示正常特征的綠色圖像，所發(fā)現(xiàn)的 5例假陽(yáng)性都發(fā)生在有明顯病灶的良性腫瘤中，2例是周邊伴有大面積炎癥的胃潰瘍患者，1例是出現(xiàn)在萎縮性胃炎中發(fā)生糜爛的地方，還有2例是間質(zhì)瘤患者的病灶上。在這些病例的病灶中是怎樣一種病理變化引起癌癥特征熒光增強(qiáng)，而這些微小的病理變化是否是潛在癌前病變前兆等一系列臨床問(wèn)題，仍有待進(jìn)一步研究和探討。然而，就這些病變而言，其間質(zhì)瘤是一種容易惡變的疾病；在反復(fù)發(fā)作胃潰瘍周邊部的炎癥容易轉(zhuǎn)化非典型增生的腸生化，這些病灶能得到及時(shí)發(fā)現(xiàn)，在診斷中仍具有警示作用，有利于對(duì)病情跟蹤和隨訪(fǎng)。

（5） 從臨床初步應(yīng)用研究中可以看到本裝置在癌癥診斷中有相當(dāng)高的敏感性，可能在癌的潛伏期還沒(méi)有形成明顯的形態(tài)特征前比其它診斷手段能早發(fā)現(xiàn)病灶。本系統(tǒng)還具有以動(dòng)態(tài)圖像（80 ms內(nèi)更換一次）的方式，通過(guò)轉(zhuǎn)動(dòng)鏡頭可實(shí)現(xiàn)大視野、大范圍采集任何檢查部位形態(tài)特征（真彩色圖像）和熒光特征（假彩色圖像）的圖像信息，非常直觀、簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、快速發(fā)現(xiàn)發(fā)生在任何部位的可疑病灶，并能在圖像的監(jiān)視中定位指示活檢，為提高早期癌癥的檢出率起到極其重要的作用，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

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