海參蟲(chóng)草復(fù)劑對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用機(jī)制的研究

王靜鳳，李曉林，張 珣，傅 佳，趙 芹，薛長(zhǎng)湖

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為糖尿病最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一，已成為糖尿病患者主要致死原因，控制和延緩DN的發(fā)展過(guò)程具有重要的臨床意義。TGF-β1在DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是早期參與介導(dǎo)DN最主要的細(xì)胞因子［1］。CTGF作為T(mén)GF-β的下游調(diào)節(jié)因子，能介導(dǎo)和調(diào)節(jié)TGF-β的促膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成，抑制其降解等作用［2］。中醫(yī)認(rèn)為海參味咸性溫補(bǔ)，蛹蟲(chóng)草味甘性溫平。二者配藥具有補(bǔ)腎益肺、養(yǎng)血生精之功效。本實(shí)驗(yàn)研究了海參蟲(chóng)草復(fù)劑(AC)對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用，并通過(guò)檢測(cè) TGF-β1、TβRⅡ和CTGF等細(xì)胞因子基因表達(dá)，以闡述AC對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制，為其合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 海參蟲(chóng)草復(fù)劑 干制日本刺參(Apostichopus japonicus)、蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)，均由市場(chǎng)購(gòu)得。海參蟲(chóng)草復(fù)劑由中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品科學(xué)與人類(lèi)健康實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)以蒸餾水配制成所需濃度的懸濁液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，♂，體質(zhì)量(200±20)g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為SCXK(京)2007-0001。

1.3 藥品及試劑 STZ為Sigma公司產(chǎn)品;微量白蛋白測(cè)試盒為上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司產(chǎn)品;TGF-β1、CTGF、TβRⅡ及 β-actin 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;Taq酶、MMLV為T(mén)aKaRa產(chǎn)品;兔抗大鼠Ⅳ型膠原多克隆抗體由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供;兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體為CST公司產(chǎn)品;葡萄糖、SOD、CAT、GSH-PX試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;TRIzol，Invitrogen產(chǎn)品;MDA試劑盒、Western及IP細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀、PCR熱循環(huán)儀均為Bio RAD產(chǎn)品;紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為日本島津產(chǎn)品;離心機(jī)為日本日立產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)為上海天能產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡為Olympus產(chǎn)品。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型建立 健康SD大鼠，禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射STZ 60 mg·kg-1。72 h后尾靜脈采血，測(cè)空腹血糖，以血糖值≥16.7 mmol·L-1者為造模成功。正常對(duì)照組(NC)注射等體積枸櫞酸緩沖液(pH=4.3)。將造模成功的大鼠按體重及血糖隨機(jī)分為模型對(duì)照組(DM)、AC低劑量組(DM+ACL，300 mg·kg-1)、AC 高劑量組(DM+ACH，1 200 mg·kg-1)，每組10只。給藥組大鼠灌胃不同濃度的AC，NC組和DM組灌胃生理鹽水，灌胃體積為1 ml(100 g·bw)-1，每天1次，共8周。

2.2 標(biāo)本收集 大鼠于末次給藥后，代謝籠單只收集24 h尿液，離心分裝，4℃保存待測(cè)。大鼠于末次給藥后，禁食不禁水5 h，尾靜脈取血20 μl，按照試劑盒方法分離上清，待測(cè)血糖水平。經(jīng)心臟插管注入4℃預(yù)冷生理鹽水灌洗至腎臟顏色發(fā)白后，摘取雙腎去掉包膜后稱(chēng)重，冰上取8 mm3腎皮質(zhì)于中性甲醛中固定，待進(jìn)行免疫組化染色。剩余腎皮質(zhì)分別切成小塊投入液氮中，待用。

2.3 大鼠血糖及尿微量白蛋白(mAlb)測(cè)定 大鼠血糖、mAlb含量參照試劑盒方法檢測(cè)，尿微量白蛋白排泄率(UAER)為mAlb含量與24 h尿量乘積。

2.4 腎皮質(zhì)中 MDA含量和SOD、CAT、GSH-PX活力測(cè)定 取0.5g凍存的大鼠腎皮質(zhì)，用冰冷生理鹽水制成10%勻漿，8 500 r·min-1離心15 min，取上清按試劑盒方法檢測(cè) MDA含量和 SOD、CAT、GSH-PX活力。

2.5 腎皮質(zhì)中 TGF-β1、TβRⅡ和 CTGF mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用 TRIzol法提取總RNA，采用兩步法RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性45 s，59℃退火 30 s，72℃延伸45 s，共28個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并進(jìn)行光度掃描，以β-actin作為內(nèi)參校正，用目的基因的吸光度與β-actin吸光度的比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)含量。引物設(shè)計(jì):TGF-β1:(+)5′-ACTACGCCAAAG AAGTCACCC-3′，(-)5′-TGAGCACTGAAGCGAAAG C-3′;TβRⅡ:(+)5′-GTGGAGGAAGAACGACAAGA A-3′，(-)5′-CACGGTAACAGTAGAAGATGGC-3′;CTGF:(+)5′-GTGACAGGGGAGGGACATT-3′，(-)5′-CAAGAACAATAGGCACAAACG-3′;β-actin:(+)5′-GCAGATGTGGATCAGCAAGC-3′， (-)5′-GTCAAAGAAAGGGTGTAAAACG-3′。

2.6 腎皮質(zhì)中TGF-β1蛋白表達(dá)檢測(cè) 取0.1 g腎皮質(zhì)加入1 ml裂解液勻漿，12 000×g離心5 min，取上清液測(cè)蛋白濃度。將上清液與6×Loading Buffer混合后，沸水浴加熱5 min，離心取上清。于4℃凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉溶液4℃封閉過(guò)夜，加入兔抗大鼠TGF-β1抗體(工作濃度1∶1 000)室溫孵育1.5 h，PBS/T洗膜3×10 min，加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體(工作濃度1∶5 000)室溫孵育膜1 h，PBS/T洗膜4×15 min。曝光底片，掃描保存為電腦文件，用ImageJ 1.4分析軟件將條帶的灰度值數(shù)字化。以NADPH作內(nèi)參，目的條帶與其相比得到相對(duì)量。

2.7 腎臟中Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)檢測(cè) 將固定的腎臟石蠟包埋，制成4 μm切片。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫組化染色，其中Ⅳ型膠原抗體工作濃度為1∶30，4℃孵育過(guò)夜;DAB顯色液15 min。實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照用0.01 mol·L-1PBS代替第一抗體，高倍鏡下每組切片選取20個(gè)腎小球，應(yīng)用圖像軟件分析系統(tǒng)計(jì)算每張切片Ⅳ型膠原陽(yáng)性表達(dá)率。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠空腹血糖、腎臟指數(shù)及UAER的影響由 Tab 1可見(jiàn)，DM組大鼠血糖、腎臟指數(shù)及UAER較NC組升高(P＜0.01)，AC能降低模型大鼠血糖并抑制其腎臟肥大(P＜0.05)，AC組UAER平均降低了34.71%。

3.2 對(duì)大鼠腎皮質(zhì)中 MDA含量和 SOD、CAT、GSH-PX活力的影響 由Tab 2可見(jiàn)，DM組抗氧化能力較NC組下降，經(jīng)AC治療后，模型大鼠腎皮質(zhì)中SOD和CAT酶活性分別平均升高了33.90%和25.25%，MDA水平降低了19.05%。說(shuō)明AC可改善高血糖引起的體內(nèi)過(guò)氧化狀態(tài)。而DM組的GSH-PX較NC組高，可能與糖尿病大鼠體內(nèi)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，GSH-PX被體內(nèi)過(guò)高的自由基激活而出現(xiàn)代償性含量增高或活性增強(qiáng)有關(guān)。

Tab 1Effects of AC on fasting plasma glucose，kidney indices and UAER in diabetic rats(±s，n=10)

Tab 1Effects of AC on fasting plasma glucose，kidney indices and UAER in diabetic rats(±s，n=10)

##P＜0.01 vs NC group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DM group

Group Dose/mg·kg-1 Initial glucose/mmol·L-1 Terminal glucose/mmol·L-1 Kidney/BW/g·kg-1 UAER/mg·(24 h)-1 NC - 5.83±0.46 6.51±0.60 6.23±0.35 0.37±0.05 DM - 21.52±2.40## 29.54±2.46## 10.50±0.82## 0.85±0.07##DM+ACL 300 21.98±2.09 24.46±3.19 9.64±1.06 0.67±0.19*DM+ACH 1 200 21.45±9.18 18.41±6.91＊＊ 8.94±1.31* 0.44±0.09＊＊

Tab 2Effects of AC on the levels of MDA and the activity of SOD，CAT and GSH-PX of kidney in diabetic rats±s，n=10)

Tab 2Effects of AC on the levels of MDA and the activity of SOD，CAT and GSH-PX of kidney in diabetic rats±s，n=10)

##P＜0.01 vs NC group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DM group

Group MDA/μmol·mg-1Pro SOD/U·mg-1Pro CAT/U·mg-1Pro GSH-PX/U·mg-1Pro NC 2.29±0.14 528.79±68.61 37.88±5.84 46.86±5.68 DM 3.28±0.15## 355.96±29.35## 24.20±3.17## 68.11±6.80##DM+ACL 2.66±0.58＊＊ 463.61±29.43＊＊ 28.69±5.96 64.40±5.74 DM+ACH 2.65±0.08＊＊ 489.69±16.66＊＊ 31.93±4.99* 55.23±5.00＊＊

3.3 對(duì)大鼠腎皮質(zhì)中 TGF-β1、TβRⅡ以及 CTGF mRNA表達(dá)的影響 PCR結(jié)果表明，DM組TGF-β1、TβRⅡ以及 CTGF mRNA表達(dá)均升高(P＜0.01)，AC能抑制三者mRNA表達(dá)。與DM組相比，AC 低、高劑量組 TGF-β1、TβRⅡ及 CTGF mRNA表達(dá)分別平均減少了27.31%、26.65%和21.45%(Fig 1)。

Fig 1 Effect of AC on the expression of TGF-β1，TβRⅡand CTGF mRNA of kidney in diabetic rats±s，n=10)##P＜0.01 vs NC group;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs DM group

3.4 對(duì)大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1蛋白表達(dá)的影響Western blot分析結(jié)果顯示，DM組大鼠腎皮質(zhì)中TGF-β1蛋白表達(dá)量約為NC組的6倍，經(jīng)灌胃AC后，其蛋白表達(dá)量平均降低了39.80%(Fig 2)。

Fig 2 Effect of AC on the expression of TGF-β1 protein of kidney in diabetic rats(±s，n=10)##P ＜0.01 vs NC group;＊＊P ＜0.01 vs DM group

3.5 對(duì)大鼠腎臟中Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的影響 由Fig 3可見(jiàn)，在正常大鼠腎臟中Ⅳ型膠原有一定的表達(dá)量，而DM組陽(yáng)性染色明顯增強(qiáng)，劑量組陽(yáng)性表達(dá)均有所減弱。對(duì)圖像定量分析顯示，與 NC組(12.01±2.34)相比，DM 組(67.21±8.79)大鼠腎皮質(zhì)中Ⅳ型膠陽(yáng)性表達(dá)率明顯增強(qiáng)(P＜0.01);AC組(38.39±6.61，22.83±4.61)Ⅳ型膠原陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低(P＜0.01)。

4 討論

在DN的發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)始終是研究的熱點(diǎn)。本研究顯示，AC給藥8周，可明顯降低糖尿病大鼠空腹血糖、腎臟指數(shù)和UAER，緩解大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)，有效抑制腎皮質(zhì)中 TGF-β1、TβRⅡ和CTGF mRNA表達(dá)，降低 TGF-β1及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)。

糖尿病狀態(tài)下多元醇代謝通路激活，抗氧化能力下降，機(jī)體氧化應(yīng)激增加［3］。研究已證實(shí)，氧化損傷和線粒體電子傳遞鏈過(guò)量產(chǎn)生的過(guò)氧化物能夠刺激腎臟TGF-β1的表達(dá)，從而導(dǎo)致糖尿病的腎臟損傷［5-6］。TGF-β是一種具有多重生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，主要存在3種異構(gòu)體，其中腎臟中以TGF-β1為主。研究表明在STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠和自發(fā)性糖尿病大鼠的腎臟中，TGF-β1mRNA及其蛋白表達(dá)均明顯升高，同時(shí)伴有腎臟肥大和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)增多［7］。人體研究也表明［8］，DN時(shí)腎小球和腎小管間質(zhì)部TGF-β1水平均升高。本研究結(jié)果表明，AC能明顯抑制糖尿病模型大鼠腎臟中TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)量，說(shuō)明抑制TGF-β1的表達(dá)和生成是AC保護(hù)糖尿病大鼠腎臟的有效途徑之一。

Fig 3 Effect of AC on the expression of collagenⅣin renal tissue A:Negative control;B:NC;C:DM;D:DM+ACL;E:DM+ACH

TGF-β1的生物活性由其受體介導(dǎo)。體外研究表明高糖狀態(tài)下腎組織細(xì)胞膜TβRⅡ表達(dá)也明顯上升［9-10］。TGF-β1與 TβRⅡ結(jié)合能直接促進(jìn)ⅣECM合成增加，并通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，使基質(zhì)降解減少，間接影響ECM堆積［11-12］。CTGF作為T(mén)GF-β1的下游調(diào)節(jié)因子，介導(dǎo)及增強(qiáng)了TGF-β1的促纖維化效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在高糖、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和TGF-β1作用下，CTGF在腎臟細(xì)胞表達(dá)均明顯增加。激活的CTGF進(jìn)而促進(jìn)Ⅰ、Ⅳ型膠原的合成［14］。在人工培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中加入TGF-β1能觸發(fā)CTGF的表達(dá)，而加入重組CTGF則增強(qiáng)了ECM蛋白的表達(dá)。高葡葡糖培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞CTGF表達(dá)增加，并能被抗TGF-β1抗體抑制。由此推斷，CTGF可能是糖尿病環(huán)境中TGF-β1誘導(dǎo)的基質(zhì)產(chǎn)生的媒介［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AC可明顯抑制糖尿病大鼠腎臟中TβRⅡ基因表達(dá)，從而降低TGF-β1活性的發(fā)揮，并明顯抑制CTGF mRNA表達(dá)，減少Ⅳ型膠原蛋白的合成。

綜上所述，AC能降低糖尿病大鼠空腹血糖，抑制腎臟肥大并減少白蛋白排泄率。其作用機(jī)制可能是AC中含有的海參多糖、海參皂苷、蟲(chóng)草素、SOD等活性物質(zhì)，升高體內(nèi)抗氧化酶的活性，清除自由基，從而減少過(guò)氧化物對(duì)TGF-β1的刺激，通過(guò)下調(diào)TβRⅡ的表達(dá)來(lái)降低TGF-β1生物活性的發(fā)揮，并抑制CTGF的表達(dá)，減少Ⅳ型膠原蛋白的合成，從而減少ECM的積聚，改善微循環(huán)，阻斷和減輕腎臟微細(xì)血管病變，減少尿蛋白排泄，以此達(dá)到保護(hù)腎臟的作用。

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