賴氨匹林對人宮頸癌HeLa細胞的抑制作用及其機制研究

張乃菊，陳天平，董淑英，張月林，李筱俊，余美玲，祝曉光

信號傳導通路在細胞分化、增殖與凋亡中起著重要作用。ERK1/2是受外界刺激時決定細胞命運的關鍵因素，ERK1/2的活化是將信號從細胞表面受體轉導至胞核的關鍵步驟，ERK1/2在刺激中被激活，同時其持續(xù)活化最終促進細胞增殖和惡性轉化。目前，賴氨匹林(即阿司匹林與賴氨酸的復鹽，主要成分為阿司匹林)對宮頸癌HeLa細胞的抑制作用是否與ERK信號通路有關尚不明確。本實驗旨在研究aspisol對宮頸癌HeLa細胞株ERK1/2、PERK1/2和COX-2蛋白表達的影響，初步探討aspisol在體外對人宮頸癌HeLa細胞的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人宮頸癌HeLa細胞株引自美國模式菌種保藏中心(ATCC)，由本實驗室保種。

1.2 藥品和試劑 aspisol購于安徽豐原藥業(yè)股份有限公司，批號081106;DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶:Gibco公司;胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購于杭州四季青公司;Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于晶美生物工程有限公司;山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記兔抗山羊IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG-HRP:中杉金橋生物技術有限公司;兔ERK-1、ERK-2多克隆抗體、小鼠P-ERK單克隆抗體、小鼠抗人GAPDH單克隆抗體、山羊COX-2多克隆抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒和Western blot熒光試劑:Santa Cruz公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細胞株常規(guī)培養(yǎng)于低糖DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為0.10 FCS，20 mmol·L－1Hepes，2.0 g·L－1碳酸氫鈉，1 ×105U·L－1青霉素和 10 mg·L－1鏈霉素)，置 37℃、0.05 CO2、0.90相對濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分為5組:陰性對照組只加等體積的低糖DMEM培養(yǎng)液的HeLa細胞;實驗組加入不同濃度的aspisol，使其終濃度分別為1、5、10 mmol·L－1;陽性藥組加入 ERK1/2 抑制劑U0126，使其終濃度為 10 μmol·L－1。

1.4 MTT法檢測aspisol對HeLa細胞的增殖抑制作用 取對數(shù)生長期的HeLa細胞，按2×107·L－1接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔接種200 μl，用含0.10小牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后采用不同的給藥方案(同“1.3”)，每組設6個復孔，實驗重復5次，加藥處理后的24、48、72 h 加入20 μl 5 g·L－1的 MTT 溶液。繼續(xù)孵育4 h后，仔細吸去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，于微量震蕩器上輕輕震蕩以使甲臢完全溶解，30 min后在492 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(A492)。根據(jù)公式計算不同濃度藥物對HeLa細胞的增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1－實驗組 A492值/陰性對照組 A492值)×100%［1］。

1.5 細胞增殖能力測定 采用Dr.Glazer報道的“標準細胞集落形成分析法”［2］測定aspisol對培養(yǎng)細胞的細胞集落(克隆)形成的影響。取對數(shù)生長期的HeLa細胞按1×108·L－1將實驗細胞接種到6孔板，每孔2 ml，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h加藥(給藥方案同“1.3”)，共同孵育1 h后經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化制備成單個細胞懸液，接種于6孔板，每孔1 000個細胞，置于37℃、0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)7 d，出現(xiàn)肉眼可見的克隆。常規(guī)吉姆薩染色，干燥后鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)。

細胞集落形成率/%=各組細胞集落數(shù)/對照組細胞集落數(shù)×100%。

1.6 流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡 取對數(shù)生長期的HeLa細胞以1×108·L－1接種于6孔板中，每孔2 ml，待細胞貼壁后加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，換新鮮培養(yǎng)液采用不同的給藥方案(同1.3)，藥物作用24 h后收集細胞。用4℃預冷的PBS洗細胞兩次，取250 μl結合緩沖液重新懸浮細胞，并使其濃度為1 ×109·L－1;取100 μl的細胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC 和10 μl 20 mg·L－1的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫避光溫育15 min。在反應管中加400 μl PBS，用流式細胞儀檢測(實驗重復3次)，結果采用Winmdi 2.9軟件分析處理。

1.7 Western blot法檢測 HeLa細胞 ERK、PERK、COX-2的表達 常規(guī)收集不同的給藥方案(同1.3)作用24 h后的宮頸癌HeLa細胞，加入冰預冷的細胞裂解液 (總體積200 ml:100 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L－1NaCl 28 ml、100 mmol·L－1CaCl21 ml、100 mmol·L－1MgCl221 ml、15 mmol·L－1NaN340 ml、Triton X-100 2 ml，用前加入蛋白酶抑制劑 12 μmol·L－1Leupeptin、1 mmol·L－1PMSF 各 2 ml·L－1)冰上裂解 30 min，提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測定細胞提取物的蛋白濃度。用細胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性。取蛋白每組40 μg，10%SDS-PAGE凝膠電泳(70 V，30 min，100 V，90 min);轉膜(200 mA，3h)至PVDF膜;50 g·L－1脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過夜);一抗:1∶500，室溫孵育2 h(或4℃過夜);TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;二抗:1∶7 000，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合;1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸;1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，放入凝膠圖像分析系統(tǒng)進行掃描和拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

2 結果

2.1 Aspisol對HeLa細胞的增殖抑制作用 隨著濃度的增加，aspisol對HeLa細胞的抑制率明顯增加(P＜0.01);每一個濃度的aspisol對HeLa細胞增殖的抑制作用隨作用時間的延長而增強。1 mmol·L－1的aspisol就能對HeLa細胞產(chǎn)生抑制作用，10 mmol·L－1的aspisol抑制作用在72 h后達到(59.1±4.7)%，見 Fig 1。

Fig 1 The inhibitory effects of aspisol on the proliferation of HeLa cells( ± s，n=6)*P ＜0.05 vs aspisol 1 mmol·L－1group

2.2 Aspisol對HeLa細胞集落形成的影響 以細胞集落形成率的降低作為aspisol的細胞毒性指標。我們按照每孔1000個的細胞濃度將HeLa細胞接種到6孔板中。7 d后出現(xiàn)肉眼可見的集落。集落形成數(shù)量在 1、5、10 mmol·L－1aspisol處理的情況下與陰性對照組相比分別降低到(96.22±0.18)%、(73.02±1.35)%、(48.17±2.05)%;U0126 10 μmol·L－1與陰性對照組相比降低到(61.27±1.25)%。aspisol(l mmol·L－1)與陰性對照組比較，差異無顯著性(P ＞0.05)，aspisol(5、10 mmol·L－1)和10 μmol·L－1U0126 與陰性對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，提示aspisol有一定的毒性作用。

2.3 Aspisol對 HeLa細胞凋亡的影響 1、5、10 mmol·L－1aspisol和 10 μmol·L－1U0126 分別作用于HeLa細胞24 h后細胞凋亡率分別為(5.74±0.87)%、(13.01±1.85)%、(23.42±3.12)%和(19.22±2.86)%，與陰性對照組(0.46±0.19)%相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.4 Western blot法檢測 aspisol對 HeLa細胞ERK、P-ERK、COX-2蛋白表達的影響 各組HeLa細胞均有兩條條帶(磷酸化ERK1/2和總ERK1/2)，上面一條帶為44 ku的ERK1(p44)，下面一條帶為 42 ku的 ERK2(p42)，磷酸化 ERK1/2是ERK1/2的活性形式。與對照組相比，陽性藥10 μmol·L－1的U0126 作用于HeLa細胞24 h后，能夠下調P-ERK1/2的表達(P＜0.01);實驗組不同濃度aspisol作用于HeLa細胞24 h后，磷酸化ERK1/2逐漸減少(P＜0.01)。這表明 aspisol抑制了ERK1/2信號傳導通路，且隨著aspisol作用濃度的增加，P-ERK1/2蛋白表達逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢，但總ERK1/2蛋白表達水平不變。

COX-2蛋白分子量為72 ku，免疫雜交后在72 ku位置出現(xiàn)陽性條帶。實驗結果顯示與對照組相比，陽性藥 U0126 10 μmol·L－1作用于 HeLa 細胞后，能夠下調COX-2的表達(P＜0.01);實驗組隨著aspisol濃度的逐漸增加，COX-2表達水平逐漸降低(P＜0.01)。內參GAPDH蛋白(分子量為37 ku)表達水平不變，見Fig 2、3。

Fig 2 The expression of the ERK and p-ERK proteins in HeLa cells after exposure to aspisol for 24 h( ± s，n=3)A:Control group;B:Aspisol 1 mmol·L －1;C:Aspisol 5 mmol·L －1;D:Aspisol 10 mmol·L －1;E:U0126 10 μmol·L －1

Fig 3 The expression of the COX-2 proteins in HeLa cells after exposure to aspisol for 24 h(±s，n=3)A:Control group;B:Aspisol 1 mmol·L －1;C:Aspisol 5 mmol·L －1;D:Aspisol 10 mmol·L －1;E:U0126 10 μmol·L －1

3 討論

非甾體抗炎藥抑制多種腫瘤細胞生長主要通過兩種途徑發(fā)揮作用，即抑制增殖及誘導凋亡，如aspisol通過抑制Survivin、C-erbB-2的表達，誘導細胞凋亡，抑制黑色素瘤細胞增殖［3］。筆者通過 MTT、細胞集落形成、流式細胞儀等實驗證實aspisol能夠有效抑制HeLa細胞增殖、誘導其凋亡，且隨著濃度的增加，抑制率和凋亡率均上升。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路的激活在細胞增殖失控引起的腫瘤發(fā)生中起重要作用。在人結腸癌、乳腺癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤中，均可檢測到ERK表達水平增高。因此推測，抑制ERK1/2的激活將可能促進腫瘤細胞凋亡的敏感性。實驗結果表明，在宮頸癌HeLa細胞中ERK1/2表達增多，陽性藥ERK通路選擇性抑制劑U0126能夠明顯下調P-ERK1/2的表達;實驗組aspisol可呈濃度依賴性抑制 HeLa細胞中磷酸化ERK1/2的表達，但不影響總ERK1/2的表達。因此，ERK1/2活性抑制可能是aspisol抑制HeLa細胞的分子機制之一。這與前期實驗結果一致［4－5］。正常的生理狀態(tài)下COX-2幾乎不表達或表達甚少，而在癌前病變組織和癌變組織中，COX-2的水平都有上升。COX-2可能是通過影響細胞的生長增殖及分化、抑制細胞凋亡、增加腫瘤侵襲力等達到致癌的作用。本實驗結果表明:HeLa細胞COX-2表達增高，aspisol呈濃度依賴性抑制COX-2的表達;ERK通路選擇性抑制劑U0126 10 μmol·L－1作用于 HeLa 細胞后，能夠下調COX-2的表達，這與劉冬妍等［6］結果一致，這表明COX-2表達可能由MAPK家族的一個成員ERK途徑調控。

綜上所述，aspisol可能是通過抑制HeLa細胞ERK1/2的磷酸化進而下調COX-2的表達，抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡而達到治療宮頸癌的目的，但ERK1/2-MAPK信號通路與COX-2途徑之間具體的細胞內信號調控機制仍不完全清楚。有文獻報道［7］在腫瘤細胞中存在著這樣的通路:蛋白激酶C→MAPK→AP-1→COX-2，AP-1的激活可促使COX-2的表達，但aspisol是否通過上述通路還有待于更深入的研究。

［1］謝松強，吳英良，程鵬飛，等.新型多胺綴合物 NNAMB誘導B16細胞凋亡及分化作用［J］.中國藥理學通報，2007，23(10):1285－90.

［1］Xie S Q，Wu Y L，Cheng P F，et al.NNAMB，a novel homospermidine conju gate，induces apoptosis and differentiation in B16 Melanoma cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(10):1285 －90.

［2］Jensen R，Glazer P M.Cell-interdependent cisplatin killing by Ku/DNA-dependent protein kinase signaling transduced through gap junctions［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004.101(16):6134 －9.

［3］鄭海倫，張月林，祝曉光.賴氨匹林對B16黑色素瘤的增殖抑制及促凋亡作用［J］.中國藥理學通報，2008，24(10):701－5.

［3］Zheng H L，Zhang Y L，Zhu X G.Inhibitory and apoptosis-inducing effects of aspisol on proliferation of B16 melanoma［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(10):701 －5.

［4］張月林，李筱俊，祝曉光，等.賴氨匹林抑制乳腺癌細胞增殖的機制初探［J］.中國癌癥雜志，2007，17(10):758 －61.

［4］Zhang Y L，Li X J，Zhu X G，et al.Preliminary study of aspisol inhibition on proliferation of breast cancer cells［J］.Chin Oncol，2007，17(10):758 －61.

［5］李筱俊，張乃菊，祝曉光，等.賴氨匹林誘導人惡性黑色素瘤A375細胞凋亡的研究［J］.腫瘤學雜志，2009，15(8):731－3.

［5］Li X J，Zhang N J，Zhu X G，et al.A study of aspisol induced apoptosis of human melanoma A375 cells［J］.J Oncol，2009，15(8):731－3.

［6］劉冬妍，李學旺，李 航，等.低鹽通過激活ERK和AP-1通路誘導小鼠致密斑細胞系COX-2的表達［J］.基礎醫(yī)學與臨床，2007，27(5):485 －9.

［6］Liu D Y，Li X W，Li H，et al.Low salt induces the expression of cyclooxygenase-2 in a mouse macula densa cells through the activation of ERK、AP-1 pathways［J］.Basic Clin Med，2007，27(5):485－9.

［7］De Lorenzo M S，Yamaguchi K，Subbaramaiah K，et al.Bryostatin-1 stimulates the transcription of cyclooxygenase-2:evidence for an activator protein-1-dependent mechanism［J］.Clin Cancer Res，2003，9(13):5036 －43.