黑靈芝多糖對體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響

張莘莘，李文娟，聶少平，謝明勇

靈芝(Gnaoderma)為擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬真菌［1］。它是我國傳統(tǒng)名貴中草藥［2］，素有“仙草”之譽(yù)，具有極高的營養(yǎng)、保健、醫(yī)療價值。我國應(yīng)用靈芝已有兩千多年的歷史，東漢時期的《神農(nóng)百草經(jīng)》最早提出將靈芝依色澤的不同劃分成赤芝、黃芝、白芝、青芝、黑芝、紫芝6種。多糖是靈芝水提物中的主要活性成分之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗證明［3］靈芝多糖活性廣泛，具有提高機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、消除機(jī)體內(nèi)自由基、抗輻射、提高肝臟解毒功能等作用。目前其增強(qiáng)免疫作用備受關(guān)注，提高免疫可以促進(jìn)機(jī)體抗病毒、抗過敏、抗疲勞以及延緩衰老等。有研究表明，增強(qiáng)免疫功能可以介導(dǎo)靈芝多糖的抗腫瘤作用［4］。目前國內(nèi)外對赤芝、紫芝已做了大量而深入的研究，但有關(guān)黑靈芝的報道卻很少，黑靈芝多糖對增強(qiáng)免疫的功效有待研究［5］。實驗通過測定腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO、TNF-α、IL-1β的分泌水平，來研究黑靈芝多糖對免疫調(diào)節(jié)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑 黑靈芝(Ganoderma atrum)采自江西贛南靈芝生產(chǎn)基地，并經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院付志紅教授鑒定。黑靈芝多糖(PSG-1)由本實驗制備，純度大于99.8%，分子量為1013 ku，主要由甘露糖、半乳糖以及葡萄糖組成，其組成比例為1∶1.28∶4.91［6］。BALB/c純系小鼠，♀♂不限，7 ～ 8 周，體質(zhì)量25～30 g。購自江西中醫(yī)學(xué)院實驗動物部，許可證號:SCXK(贛)2006-0001。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(lán)溶液(MTT)、脂多糖(LPS)美國 Sigma公司;小鼠 TNF-α、IL-1β，ELISA試劑盒，上海森雄科技實業(yè)有限公司;一氧化氮(NO)試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備 3K15-高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，深圳國華電器有限公司;METTLER TOLEDO AL104電子天平，梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;CO2培養(yǎng)箱、E-330酶標(biāo)儀，美國Thermo公司;超凈工作臺，吳江市凈化設(shè)備總廠;倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 將小鼠頸椎脫臼處死，先放入碘伏中3～5 min，再放入體積分?jǐn)?shù)為0.75的酒精中浸泡5 min脫色，腹腔注入10 ml PBS緩沖液，輕揉腹部1～2 min后吸取腹腔液于離心管中，以1 000×g離心6 min，棄上清液收集巨噬細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞＞0.95，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×108·L－1。以每孔150 μl接種于 96 孔板中，置 5%CO2，37℃培養(yǎng)，4 h后用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，即得純化的腹腔巨噬細(xì)胞。

1.2.2 設(shè)計及分組 在96孔板中每孔加入巨噬細(xì)胞懸浮液100 μl(1.5 ×108·L－1)，進(jìn)行分組處理。分別加入不同體積的黑靈芝多糖，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液補(bǔ)充至每孔200 μl，使多糖終濃度為20，40，80，160 mg·L－1;另設(shè) LPS+多糖組:用LPS(終濃度10 mg·L－1)激活巨噬細(xì)胞，同時按上述終濃度分別加入多糖。每個質(zhì)量濃度設(shè)置4個復(fù)孔，并設(shè)陰性對照孔(只含細(xì)胞)和陽性對照孔(LPS，10 mg·L－1)。在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 腹腔巨噬細(xì)胞代謝MTT活力測定 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔再加入150 μl MTT液(5 mg·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，移去微孔中所有液體，再加入150 μl DMSO終止反應(yīng)，用振蕩儀振蕩10 min后，酶標(biāo)儀檢測492 nm處吸光度(A)。

1.2.4 腹腔巨噬細(xì)胞NO生成的測定 在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)2 d后，分別吸取上清液，按Griess法測定樣品中的N02－/NO3－，用以反映NO的水平［7］。

1.2.5 TNF-α、IL-1β 的測定方法 采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，具體操作方法按照森雄試劑盒說明書進(jìn)行。在酶標(biāo)儀492 nm處測定吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 黑靈芝多糖對巨噬細(xì)胞代謝MTT活力的影響 由Tab 1可見，在有或無LPS誘導(dǎo)下，黑靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞代謝MTT活力有增強(qiáng)作用，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.01)，且增強(qiáng)作用呈劑量依賴性。推測這可能是黑靈芝多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的方式之一。

Tab 1 Effects of polysaccharide of Ganoderma atrum(PSG-1)in the induction of metabolic activity of MTT in peritoneal macrophages±s，n=6)

Tab 1 Effects of polysaccharide of Ganoderma atrum(PSG-1)in the induction of metabolic activity of MTT in peritoneal macrophages±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal control

Group Dose/mg·L－1 MTT(A value)Normal control 0.680 ±0.031 Positive control(LPS)10 0.701 ±0.056*PSG-1 20 0.749 ±0.016＊＊40 0.914 ±0.029＊＊80 1.007 ±0.059＊＊160 1.056 ±0.105＊＊LPS+PSG-1 10+20 0.827 ±0.023＊＊10+40 0.907 ±0.058＊＊10+80 0.960 ±0.030＊＊10+160 0.970 ±0.020＊＊

2.2 Griess法測定黑靈芝多糖對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 Tab 2中可以看出，黑靈芝多糖能明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO，在低濃度20 mg·L－1既有作用(P ＜0.05)，并且當(dāng)多糖濃度 ＞40 mg·L－1時，NO生成量可超過LPS組水平(P＜0.01)。呈劑量依賴性增強(qiáng)。

Tab 2 Effects of polysaccharide from Ganoderma atrum(PSG-1)on NO production by macrophages ±s，n=6)

Tab 2 Effects of polysaccharide from Ganoderma atrum(PSG-1)on NO production by macrophages ±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs positive control

Group Dose/mg·L－1 NO2－ /μmol·L －1 Normal control 16.638 ±0.107 Positive control(LPS)10 25.149 ±0.037＊＊PSG-1 20 18.057 ±0.051*40 26.234 ±0.022＊＊80 35.851 ±0.028＊＊160 40.926 ±0.101＊＊LPS+PSG-1 10+20 23.798 ±0.023#10+40 21.415 ±0.018##10+80 19.319 ±0.030##10+160 17.082 ±0.021##

LPS+多糖組結(jié)果顯示，黑靈芝多糖對LPS誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生有明顯的抑制作用(P＜0.05)。在20～160 mg·L－1范圍內(nèi)，這種抑制效果呈劑量依賴性(Tab 2)。

2.3 黑靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β的影響 結(jié)果表明(Tab 3)，多糖刺激正常的腹腔巨噬細(xì)胞，黑靈芝多糖明顯地促進(jìn)TNF-α、IL-1β 的釋放(P ＜0.01)。在濃度20 mg·L－1時即可明顯的促進(jìn) IL-1β、TNF-α 的釋放(P＜0.01)，且在20～80 mg·L－1的范圍內(nèi)效果最明顯(P＜0.01)。

Tab 3 Effects of polysaccharide from Ganoderma atrum(PSG-1)on TNF-α and IL-1β production by macrophages(±s，n=6)

Tab 3 Effects of polysaccharide from Ganoderma atrum(PSG-1)on TNF-α and IL-1β production by macrophages(±s，n=6)

＊＊P ＜0.01 vs normal control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs positive control

Group Dose/mg·L －1IL-1β/ng·L －1 TNF-α/ng·L －1 Normal control 31.442 ±0.015 61.491 ±0.011 Positive control(LPS)10 50.891 ±0.116＊＊ 80.850 ±0.017＊＊PSG-1 20 47.303 ±0.128＊＊ 70.669 ±0.112＊＊40 60.421 ±0.032＊＊ 83.028 ±0.510＊＊80 73.615 ±0.015＊＊ 100.977 ±0.453＊＊160 78.021 ±0.226＊＊ 108.414 ±0.112＊＊LPS+PSG-1 10+20 46.261 ±0.135# 79.621 ±0.362#10+40 44.123 ±0.523## 74.303 ±0.225##10+80 39.824 ±0.341## 64.314 ±0.423##10+160 40.575 ±0.212## 64.681 ±1.210##

測定LPS+PSG-1組上清中TNF-α、IL-1β的濃度，結(jié)果顯示，黑靈芝多糖分別不同程度的抑制經(jīng)LPS激活腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β的水平(P ＜0.05)，低劑量 20 mg·L－1時就有效果(P ＜0.05)，尤以濃度為40～80 mg·L－1的多糖效果最明顯(P＜0.01)。

3 討論

巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及抗原呈遞等，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著重要作用。大量研究表明，活化的巨噬細(xì)胞具有廣譜殺瘤作用［8］，通過釋放 NO、IL-1β、TNF-α［9］、IL-6、IL-12 等增加表面分子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，殺滅病原微生物。NO是激活的巨噬細(xì)胞殺滅病原微生物及腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，能提高機(jī)體免疫［10］。但過量的NO也會促進(jìn)炎癥發(fā)生，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子如 IL-1β、TNF-α等。TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的啟動因子，在炎癥反應(yīng)中TNF-α不僅能直接參與炎癥反應(yīng)，還能誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子釋放，共同對組織造成損傷［11］。它與其他細(xì)胞因子形成相互作用的信號網(wǎng)絡(luò)，刺激細(xì)胞合成、表達(dá)IL-1β。IL-1β和TNF-α通過協(xié)同作用誘發(fā)炎癥反應(yīng)。IL-1β也是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)功能、可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)以及機(jī)體防御反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子，在多種臟器損傷中起著重要作用，它還可以誘導(dǎo)NOS和NO的產(chǎn)生。適量的NO、IL-1β、TNF-α等可以活化巨噬細(xì)胞、殺滅病原微生物，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，且還具有抗細(xì)菌、抗病毒和抗腫瘤活性。然而它們也是重要的炎癥介質(zhì)。在炎癥反應(yīng)初期，適量的 NO、IL-1β、TNF-α是機(jī)體對抗炎癥的積極反應(yīng)，但若它們持續(xù)不斷地釋放則會導(dǎo)致炎癥不斷擴(kuò)大、加重。并且有研究表明，巨噬細(xì)胞受IFN-γ等細(xì)胞因子和LPS誘導(dǎo)活化后，會合成并釋放大量NO、IL-1β、TNF-α 等炎癥介質(zhì)［12］，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)，對組織器官造成損傷。我們也得到了同樣的結(jié)果，多糖激活正常的腹腔巨噬細(xì)胞，促進(jìn)NO、IL-1β、TNF-α產(chǎn)生，活化細(xì)胞殺滅病原微生物，發(fā)揮積極作用。LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后，NO、IL-1β、TNF-α 的分泌增加，加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

本實驗經(jīng)體外培養(yǎng)，研究了黑靈芝多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO、IL-1β、TNF-α生成的影響。結(jié)果表明，黑靈芝多糖可促進(jìn)正常巨噬細(xì)胞活化并釋放NO、IL-1β、TNF-α，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。當(dāng)巨噬細(xì)胞受LPS誘導(dǎo)活化后，黑靈芝多糖會使NO、IL-1β、TNF-α分泌減少，表明黑靈芝多糖可以通過抑制NO、IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用，為黑靈芝的進(jìn)一步研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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