散血明目片對(duì)兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞后視網(wǎng)膜組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響

彭清華 張波濤 葉群如 曾志成 韓 琦 姚小磊

2湖南省桂陽縣人民醫(yī)院眼科

3遼寧省沈陽市第一人民醫(yī)院眼科

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（Retinal vein occlusion，RVO）是臨床上較常見的、容易導(dǎo)致視力喪失的眼底疾病之一，也是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的致盲性視網(wǎng)膜血管病〔1〕。視網(wǎng)膜靜脈阻塞的發(fā)病原因存在多種，具體的發(fā)病機(jī)制尚不完全明了?，F(xiàn)代研究顯示視網(wǎng)膜靜脈阻塞后視網(wǎng)膜局部組織的血流灌注減少，繼而血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧可使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)增加〔2〕。 散血明目片有活血通脈利水明目之功效，已往研究證實(shí)其對(duì)玻璃體積血等眼底出血患者有較好的臨床療效〔3〕。本實(shí)驗(yàn)用活血通脈利水明目之散血明目片混懸液對(duì)兔RVO模型進(jìn)行灌胃，觀察其對(duì)兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞后iNOS表達(dá)的干預(yù)作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：健康有色家兔18只，雌雄各半，4～6月齡，體重2.0～2.5 kg（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：湘醫(yī)動(dòng)字第20-003號(hào)）。

1.1.2 藥物：散血明目片：由三七、酒大黃、蒲黃、豬苓、防己、地龍、白茅根等活血通脈利水明目中藥按現(xiàn)代制劑制備工藝制成，0.3 g/片，選用同一批號(hào)藥物（批號(hào)020624）。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。使用時(shí)研成粉末，溫開水混合成100 ml含散血明目片12 g的混懸液。

1.1.3 儀器與試劑：萊特眼底激光治療儀（法國光太公司）；CF-60UD眼底熒光造影（FFA）儀（日本佳能公司）；裂隙燈顯微鏡，直接檢眼鏡，角膜接觸鏡等。一氧化氮試劑盒（酶法）、iNOS多克隆抗體、液體DAB酶底物顯色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組6只。分別為：正常對(duì)照組、模型組、散血明目片組。將模型組、散血明目片組實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前12小時(shí)禁食禁水，造模前每只家兔交替點(diǎn)1%阿托品滴眼液和托品卡胺滴眼液充分?jǐn)U瞳，先做正常眼底彩色照相及眼底熒光血管造影。隨機(jī)摘除正常對(duì)照組1只家兔的雙眼，置于固定液中，固定至少48小時(shí)以上，作為正常對(duì)照。視網(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO）模型參照周正申等〔4〕介紹的采用激光光凝視網(wǎng)膜中央靜脈造模法制造。1%的卡因滴眼液雙眼角膜表面麻醉后，通過三面鏡應(yīng)用氬藍(lán)-綠激光（488 nm，514 nm）直接光凝視網(wǎng)膜靜脈上、下主干。初次光凝能量選擇280～340 mW，光凝點(diǎn)數(shù)依具體情況而定，曝光時(shí)間0.1秒，光斑直徑100 μm。激光光凝封閉靜脈時(shí)準(zhǔn)確聚焦于靜脈，避免損傷鄰近的動(dòng)脈。光凝封閉的靜脈段長度約1DD，直至被封閉的靜脈段變細(xì)發(fā)白，血流停滯，其遠(yuǎn)端迂曲擴(kuò)張。光凝時(shí)由遠(yuǎn)端向近端照射，以免光凝處靜脈內(nèi)壓力過高而破裂，影響操作。激光光凝封閉視網(wǎng)膜靜脈后，即作眼底彩色照相及眼底熒光血管造影（FFA），觀察血管閉塞情況，若閉塞不完全則補(bǔ)充光凝封閉。一般情況下補(bǔ)充光凝1次就足夠，過度光凝視網(wǎng)膜靜脈上下主干，往往由于過于強(qiáng)烈的組織反應(yīng)使視網(wǎng)膜壞死。24小時(shí)后再復(fù)查FFA，證實(shí)視網(wǎng)膜靜脈上、下主干完全阻塞。

1.2.2 給藥方法：正常對(duì)照組、模型組每日以0.9%生理鹽水灌胃；散血明目片組每日以散血明目片混懸液按0.25 g/kg灌胃（成人臨床劑量為0.17 g/Kg），各組給藥體積均為2 ml/kg。連續(xù)用藥3周，1次/天。

1.2.3 取材及標(biāo)本的制備：造模后14天用空氣栓塞法將動(dòng)物處死，迅速摘取標(biāo)本浸入裝有4%多聚甲醛的廣口瓶中，固定24小時(shí)后脫水，于角膜緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)和玻璃體，余下的眼杯，用石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，做免疫組化備用。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定：對(duì)iNOS進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、DAB顯色、蘇木素復(fù)染胞核、分化返藍(lán)、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察相關(guān)抗原的表達(dá)變化，以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)信號(hào)。其中以已知的陽性片為陽性對(duì)照；以PBS取代一抗作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照不著色。iNOS表達(dá)的結(jié)果以平均光密度值和平均灰度值表示，平均光密度越大，表示相關(guān)的抗原表達(dá)越強(qiáng)；平均灰度值越小，表示相關(guān)的抗原表達(dá)越強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較方差齊者用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett’T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色病理觀察

正常對(duì)照組切片為正常視網(wǎng)膜組織；模型組：可見視網(wǎng)膜組織內(nèi)層神經(jīng)纖維層已受到嚴(yán)重?fù)p害，內(nèi)核層與外核層均變?。簧⒀髂科M：與模型組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較，視網(wǎng)膜組織內(nèi)層神經(jīng)纖維層，內(nèi)核層及外核層厚度均增加，僅有少量空泡（圖1）。

2.2 iNOS免疫組化活性表達(dá)計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果

經(jīng)平均光密度值和平均灰度值的組間相互比較，3組 iNOS的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組iNOS表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組與散血明目片組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。散血明目片組iNOS表達(dá)雖顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但較模型組低（表1）。

表1 三組視網(wǎng)膜組織iNOS表達(dá)的比較 （±s）

表1 三組視網(wǎng)膜組織iNOS表達(dá)的比較 （±s）

注：①模型組與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；②散血明目片組與模型組比較，P＜0.01。

3 討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞屬中醫(yī)“暴盲”、“絡(luò)損暴盲”范疇，因眼部血液運(yùn)行受阻，溢于脈外，導(dǎo)致眼底出血、視力下降，其眼血液動(dòng)力障礙、血液流變性異常、血小板聚集及全身微循環(huán)障礙等與典型的中醫(yī)血瘀證的特點(diǎn)相一致。但僅對(duì)瘀血治療是不夠的，RVO患者在臨床上除有出血表現(xiàn)外，由于血管阻塞，脈中津液也一起外滲，往往伴有視網(wǎng)膜的水腫，滲出，不少患者還伴有黃斑囊樣水腫，其病變過程中始終存在著水血夾雜的病機(jī)，在病變的中后期又表現(xiàn)為水血互結(jié)。正如唐容川在《血證論》所述：“血病而不離乎水”；“血積既久，其水乃成”；“水病而累及血，瘀血化水”。由于水與血在生理上同源，病理上互累，因而必須水血同治。通過總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合自己的臨床實(shí)踐，我們認(rèn)為在本病的整個(gè)治療過程中應(yīng)采用活血利水之法，即不僅要活血通脈，而且要利水散結(jié)明目，組方使用散血明目片。

前期的臨床研究表明〔5〕：活血藥與利水藥配合使用，可加快出血的吸收，從而促進(jìn)病變的恢復(fù)?；颊呓?jīng)活血通脈利水明目法治療后，其血液流變學(xué)指標(biāo)明顯改善。另外，散血明目片還能促進(jìn)玻璃體積血的吸收，改善眼底的狀況，改善全身的血液流變性，降低血液粘滯性和聚集性，降低血小板的活化功能，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損等，從而全面改善患者的血瘀狀況，加速積血的清除，提高玻璃體積血患者的視功能〔6，7〕；能夠明顯降低兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞 RVO模型內(nèi)皮素 1（endothelin 1，ET-1）表達(dá)，抑制其 1 型纖溶酶原激活物抑制物（type-1 plasminogen activator inhibitor，PAⅠ-1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在視網(wǎng)膜上高表達(dá)，誘導(dǎo)組織纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen activator，tPA）的高表達(dá)，抑制血栓形成〔8-10〕。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是體內(nèi)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化 L-精氨酸釋放的一種小分子內(nèi)源性反應(yīng)氣體，在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)作用，能夠舒張眼部微血管，調(diào)節(jié)眼部的血流量。研究發(fā)現(xiàn)，RVO發(fā)生后視網(wǎng)膜會(huì)很快出現(xiàn)局限性NO生成和釋放減少，而使微小動(dòng)脈收縮，NO失衡是RVO毛細(xì)血管無灌注區(qū)形成的主要原因〔11〕。

現(xiàn)已證明，在生理狀態(tài)下血管系統(tǒng)內(nèi)的NO主要由內(nèi)皮細(xì)胞中的組成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）催化合成，但其活性維持時(shí)間較短；在病理狀態(tài)或在內(nèi)毒素及某些細(xì)胞因子刺激下，NOS的另一種異構(gòu)體誘導(dǎo)型NOS（iNOS）將被激活〔12〕，其產(chǎn)生的NO，適量可補(bǔ)償內(nèi)源性NO不足，過量可引起細(xì)胞和組織損傷，且持續(xù)時(shí)間較長。NO化學(xué)性質(zhì)非常活潑，在體內(nèi)半衰期僅有5s，較難測(cè)定，故組織中NO的水平主要取決于其中NOS的活性。NOS是NO生物合成的關(guān)鍵酶（限速酶），通過檢測(cè)NOS可以反映NO水平。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三組的平均光密度值和平均灰度值的組間相互比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組iNOS表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），表明造模成功；散血明目片組iNOS表達(dá)低于模型組（P＜0.01），因而推測(cè)散血明目片可以減弱兔RVO模型視網(wǎng)膜由于缺氧而誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)，減輕NO過量生成對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞造成的毒性傷害作用。

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