Bmi-1在胰腺癌組織中的表達及其意義

殷濤 冷振偉 楊智勇 吳河水 王春友

·論著·

Bmi-1在胰腺癌組織中的表達及其意義

殷濤 冷振偉 楊智勇 吳河水 王春友

目的檢測Bmi-1在胰腺癌組織中的表達，分析其與胰腺癌臨床病理特征之間的關系。方法實時熒光定量PCR法檢測22例手術(shù)切除的新鮮胰腺癌組織及配對癌旁組織中Bmi-1 mRNA的表達；免疫組織化學法檢測61例胰腺癌石蠟塊標本中Bmi-1、p16蛋白的表達，并分析與臨床病理指標的關系。結(jié)果22例胰腺癌組織中Bmi-1 mRNA的相對表達量為0.314±0.040，與配對的癌旁組織0.143±0.056的表達量相差顯著(P<0.01)。61例胰腺癌組織中36例(59.0%)Bmi-1蛋白表達陽性，34例(55.7%)p16蛋白表達缺失。胰腺癌組織Bmi-1的陽性表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P=0.025)；p16的表達缺失與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(P=0.020)及腫瘤分化程度(P=0.018)相關；Bmi-1蛋白表達與p16蛋白表達呈負相關(P=0.033)。結(jié)論Bmi-1在胰腺癌組織中表達增加，它可能通過抑制p16表達調(diào)控胰腺癌的惡性生物學行為。

胰腺腫瘤； 干細胞因子； Bmi-1; 基因，p16; 表達

胰腺癌干細胞學說認為，胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展可能是由特定的腫瘤干細胞樣亞群維系的，一些過度活化的信號通路通過調(diào)控胰腺癌干細胞的異常活化進而導致胰腺癌高度惡性的生物學行為。Bmi-1是新近發(fā)現(xiàn)的Polycomb蛋白家族成員，也是一種重要的腫瘤干細胞因子， 它在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達，并調(diào)控腫瘤的進展[1]。本實驗檢測Bmi-1及其下游基因p16在胰腺癌中的表達，探討其與腫瘤臨床病理指標間的相關性。

材料與方法

一、組織標本

收集2000年至2006年我院手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實的胰腺癌石蠟塊標本61例。其中37例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，9例有遠處轉(zhuǎn)移；高分化19例，中分化16例，低分化26例。另取3例正常胰腺組織、5例慢性胰腺炎(CP)組織標本作為對照。同時收集22例手術(shù)切除的新鮮的胰腺癌組織以及配對的癌旁組織，置液氮保存。

二、免疫組織化學法檢測Bmi-1、p16蛋白表達

SP免疫組化試劑盒購自福州邁新公司，嚴格按照試劑說明書操作。 PBS代替一抗作為陰性對照。 鼠抗人Bmi-1多克隆抗體、兔抗人p16多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術(shù)公司。結(jié)果判定：胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Bmi-1蛋白陽性表達，在×200光鏡下隨機選取6個視野，每個視野計數(shù)50個細胞，以陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分計算，<10%為陰性，≥10%為陽性。以胞膜和胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為p16蛋白陽性表達， ≤5%為p16表達缺失，>5%為p16陽性表達。

三、熒光定量PCR法檢測Bmi-1 mRNA表達

采用Trizol(Life Technologies公司)法提取總RNA。 通過逆轉(zhuǎn)錄反應獲得cDNA，然后行熒光定量PCR。Bmi-1引物為：正義：5′-CTGGTTGCCCATTGACAGC-3′，反義5′-CAGAAAATGAATGCGAGCCA-3′；在FTC-2000型熒光定量PCR儀上進行PCR反應。反應條件：95℃ 10 min，94℃ 30 s ，51℃ 30 s，72℃ 30 s。50個循環(huán)。Bmi-1 mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT法[2]計算。

四、統(tǒng)計學分析

p16、Bmi-1相關性分析采用χ2檢驗，表達量的差異性分析采用t檢驗，P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。應用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。

結(jié) 果

一、Bmi-1 mRNA在胰腺癌組織中的表達

22例胰腺癌組織Bmi-1 mRNA的相對表達量為0.314±0.040，而配對的癌旁組織Bmi-1 mRNA的相對表達量為0.143±0.056，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.758,P<0.0001)。

二、Bmi-1蛋白表達及與胰腺癌臨床病理特征的關系

Bmi-1表達于細胞的胞核和胞質(zhì)。胰腺癌組織Bmi-1蛋白陽性表達率為59.0%(36/61，圖1)。正常胰腺、癌旁組織及CP組織的Bmi-1均陰性表達。

胰腺癌組織Bmi-1蛋白表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度及遠處轉(zhuǎn)移均無相關性，僅與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關。37例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中26例Bmi-1蛋白表達陽性，24例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中10例Bmi-1蛋白表達陽性，兩者相差顯著(P=0.025，表1)。

三、p16 蛋白的表達及與胰腺癌臨床病理特征的關系

正常胰腺組織中p16蛋白表達陽性。 61例胰腺癌組織中34例(55.7%)p16蛋白表達缺失(圖2)，27例(44.3%) p16蛋白陽性表達。p16的表達缺失與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移(P=0.02)及腫瘤分化程度(P=0.018)相關(表2)。

圖1Bmi-1在胰腺癌中的陽性表達( ×100)圖2p16在胰腺癌中表達缺失( ×100)

表1 胰腺癌組織Bmi-1蛋白表達與臨床病理特征的關系

注：aP<0.05

表2 胰腺癌組織p16 蛋白的表達與臨床病理特征的關系

注：aP< 0.05

四、胰腺癌Bmi-1和p16蛋白表達的相關性

34例p16缺失表達的胰腺癌組織中，24例Bmi-1蛋白表達陽性；27例p16陽性表達的胰腺癌組織中，12例Bmi-1表達陽性。兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.033)，同時兩者呈負相關。

討 論

最初發(fā)現(xiàn)Bmi-1與癌基因c-myc協(xié)同在鼠淋巴瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮作用[3]。隨后的研究證實，Bmi-1通路可以調(diào)控白血病干細胞、乳腺癌干細胞的增殖和自我更新能力[4-5]。 現(xiàn)已證實，胰腺癌干細胞的Bmi-1呈活化狀態(tài)[6]。本實驗結(jié)果顯示，Bmi-1mRNA或蛋白在胰腺癌組織中的表達量都較高，而正常胰腺及CP中則呈陰性表達，進一步證實Bmi-1信號通路在胰腺癌組織中處于異?；罨癄顟B(tài)。同時胰腺癌Bmi-1表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，表明它參與調(diào)控胰腺癌的惡性生物學行為。

p16是一種細胞周期負性調(diào)控蛋白，通過對細胞周期依賴激酶CDK的抑制，干擾pRb蛋白的磷酸化，阻滯細胞周期于G1期。p16在多種惡性腫瘤組織的表達呈抑制狀態(tài)。本組55.7%的胰腺癌組織p16表達缺失，并與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及腫瘤分化程度相關，提示p16的缺失參與了胰腺癌的進展。

p16是Bmi-1的重要靶基因，Bmi-1的過度活化可導致p16的異常沉默[7]。本實驗結(jié)果亦顯示，胰腺癌組織Bmi-1的高表達，而p16的表達被抑制。當然Bmi-1的作用方式非常復雜，它可不依賴于INK4A/ARF[8]而與其他信號通路如NF-κB、PI3K-Akt等協(xié)同作用調(diào)控腫瘤惡性生物學行為[9-10]。

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[5] Lessard J,Sauvageau G.Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells.Nature,2003,423:255-260.

[6] Lee CJ,Dosch J,Simeone DM. Pancreatic cancer stem cells.J Clin Oncol,2008,26:2806-2812.

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2010-01-28)

(本文編輯：屠振興)

ExpressionandsignificanceofBmi1inpancreaticcarcinoma

YINTao,LENGZhen-wei,WUHe-shui,WANGChun-you.

CenterofPancreasSurgery.UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

YINTao,Email:whuh608@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Bmi-1 in pancreatic cancer.MethodsThe expression of Bmi-1 mRNA was detected in pancreatic cancer and matched adjacent normal tissues by using real-time PCR in 22 cases of human pancreatic carcinoma. Bmi-1 and p16 protein were determined in 61 cases of human pancreatic carcinoma with immunohistochemistry and their relationship with clinicopathologic parameters was analyzed.ResultsThe expression of Bmi-1 mRNA was 0.314±0.040 in cancerous tissues, and 0.143±0.056 in adjacent normal tissues, and the difference was statistically significant (P<0.01). 36 cases (59.0%) of PC were detected with positive expression of Bmi-1 protein, and 34 cases (55.7%) with no expression of p16 protein. The expression of Bmi-1 was significantly correlated with lymph node metastasis (P=0.020) and tumor differentiation (P=0.018); the expression of Bmi-1 was negatively correlated with the expression of p16 (P=0.033).ConclusionsExpression of Bmi-1 was increased in pancreatic cancer, which may be involved in the malignant behavior of pancreatic cancer by inhibiting p16 expression.

Pancreatic neoplasms; Stem cell factor; Bmi-1; Genes,p16; Expression

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.018

國家自然科學基金(30801100)；湖北省生物靶向治療研究重點實驗室開放研究課題(2007B09)

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺外科中心(殷濤、楊智勇、吳河水、王春友)；湖北省生物靶向研究重點實驗室(殷濤)；華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腔鏡外科中心(冷振偉)

殷濤，Email:whuh608@yahoo.com.cn