半夏白術(shù)天麻湯4種方法提取液指紋圖譜比較

王淑玲，孫秀梅，張兆旺，謝 恬

(1.杭州師范大學(xué) 生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 310012；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250014)

半仿生提取法(Semi-bionic extraction,SBE法)是張兆旺教授和孫秀梅教授以灰思維為指導(dǎo)，為經(jīng)消化道給藥的中藥及其復(fù)方，提出的一種中藥藥效物質(zhì)提取新技術(shù)[1-6]，為了提高仿生化程度，在SBE法的基礎(chǔ)上加入適宜的生物酶，形成了半仿生-生物酶法(Semi-bionic enzyme extraction,SBEE法)[7-8].半夏白術(shù)天麻湯來源于清代程國(guó)彭的《醫(yī)學(xué)心悟》，由半夏、白術(shù)、橘紅、甘草、天麻、茯苓6味中藥組成，具有燥濕化痰、平肝息風(fēng)的作用.主治風(fēng)痰上擾所致眩暈頭痛,胸悶嘔惡,舌苔白膩,脈弦滑等癥.現(xiàn)代主要用于高血壓、美尼爾氏綜合征、癲癇、中風(fēng)后遺癥等，是治療風(fēng)痰癥的常用方，已有270余年的臨床基礎(chǔ)，現(xiàn)代仍廣泛用于中醫(yī)臨床.目前該方的提取方法仍采用水提法.水提法易導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分的流失，王淑玲等用SBEE法對(duì)半夏白術(shù)天麻湯進(jìn)行了系統(tǒng)研究，SBEE法可以最大程度的提取活性混合物，克服水提法的缺點(diǎn).實(shí)驗(yàn)首先優(yōu)選了SBEE法提取工藝條件和較佳組合方式，然后對(duì)半夏白術(shù)天麻湯4種提取液(水提法、醇提法、SBE法、SBEE法)的指標(biāo)成分進(jìn)行比較(待發(fā)表)，在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步比較不同提取液中成分的差異，該實(shí)驗(yàn)采用HPLC法，對(duì)不同方法提取液指紋圖譜進(jìn)行分析比較.指紋圖譜具有綜合的特點(diǎn)，適合作為含有多成分的中藥及其復(fù)方的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，目前利用指紋圖譜研究半夏白術(shù)天麻湯較少.

1 儀器與材料

Agilent1100LC、G1311A四元泵、Agilent1100LC色譜工作站G1315A/BDAD檢測(cè)器、G1316A柱溫箱、Agilent1100LC在線真空脫氣機(jī)、VP-ODS Shim-pack柱(5 μm，4.6 mm×250 mm，日本島津公司)，LD5-10B低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠).乙睛色譜純(天津四友公司)，水為高純水，其余試劑均為分析純.

半夏白術(shù)天麻湯方中藥材飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張兆旺教授鑒定：半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥塊莖；天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖；茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(schw.)Wolf.的干燥菌核；橘紅為蕓香科植物柚Citrusgrandis(L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮；白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根及根莖.

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 樣品液的制備

王淑玲等課題組提供.

2.2 供試液的制備

分別取樣品液各900 mL，分別離心(3 000 r/min，20 min)，合并上清液，濃縮并定容至500 mL，即得供試液A1～4(0.165 6 g/mL).精密吸取供試液A1～4各10 mL于磨口三角瓶中，慢慢加入乙醇使含醇量至50%，超聲提取(250 W，40 KHz)30 min，放冷，濾過，濃縮至近干，殘?jiān)右译?水(3∶97)混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并用乙腈-水(3∶97)混合溶液定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試液B1～4(0.331 2 g/mL).

2.3 流動(dòng)相的確定

選擇甲醇-水多個(gè)比例和乙腈-水多個(gè)比例的流動(dòng)相.結(jié)果表明，多種流動(dòng)相中以乙腈(A)-水(B)，線性梯度洗脫時(shí)間為0 min→45 min(A%：5%→45%)，45 min→60 min(A%：45%→100%)系統(tǒng)為較佳，圖譜顯示各個(gè)色譜峰(nm)的分離度較好，保留時(shí)間適中，因此選此流動(dòng)相系統(tǒng)作為流動(dòng)相.

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過紫外全波長(zhǎng)掃描，選擇220 nm、250 nm、280 nm、324 nm、414 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行考察，通過DAD檢測(cè)三維圖譜，比較這5種檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示λ=324 nm時(shí)，圖譜基線平穩(wěn)，指紋峰數(shù)適中，分離度較好.因此選擇λ=324 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

2.5 色譜條件

色譜柱：DiamonsilTM(鉆石)C18柱(200×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)；線性梯度洗脫時(shí)間程序如下：0 min→45 min(A%：5%→45%)，45 min→60 min(A%：45%→100%)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：324 nm；參比波長(zhǎng)：400 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量20 μL.在此條件下，半夏白術(shù)天麻湯指紋色譜圖中色譜峰較多，分離度好，特征性強(qiáng)，基線平穩(wěn).

2.6 共有特征指紋峰的標(biāo)定

選擇12個(gè)分離度好、峰面積較大的峰作為特征峰.各特征峰見圖1.其中8號(hào)色譜峰(RT≌31.16 min，A%≌22.57%)積分百分比較大，且位于色譜峰的較中間位置，分離度較好，以此作為內(nèi)參照峰.

圖1 半夏白術(shù)天麻湯SBEE液指紋圖譜Fig. 1 Fingerprint of Banxia Baizhu Tianma Decoction by SBEE

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下供試液B1，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.5項(xiàng)下液相色譜條件，依法測(cè)定，記錄各共有峰保留時(shí)間和積分面積.以8號(hào)峰的保留時(shí)間(RT)和積分面積(A)為參照，換算出各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間(RRT)和相對(duì)積分面積(RA).結(jié)果顯示共有峰的RRT和RA基本一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%(RSD<3%).HPLC法分析精密度良好，見表1、表2.

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下供試液B1，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.5項(xiàng)下液相色譜條件，依法測(cè)定，共有峰的RRT和RA基本一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%(RSD<3%).結(jié)果表明樣品液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，見表3、表4.

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取2.1項(xiàng)下A1號(hào)供試液，按2.2項(xiàng)下供試液的制備方法平行提取5份，按2.5項(xiàng)下色譜條件，依法測(cè)定，考察各個(gè)特征峰的RRT和RA，結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%.見表5、表6.

2.10 HPLC積分總面積測(cè)定

精密吸取2.2項(xiàng)下不同提取液的供試液B，分別平行進(jìn)3針，按2.5項(xiàng)下液相色譜條件，依法測(cè)定，結(jié)果見表7.

表1 特征峰相對(duì)保留時(shí)間(RRT)的精密度(n=6)

表2 特征峰積分相對(duì)比值(RA)的精密度(n=6)

表3 特征峰相對(duì)保留時(shí)間(RRT)的穩(wěn)定性(n=5)

表4 特征峰積分相對(duì)比值(RA)的穩(wěn)定性(n=5)

表5 特征峰相對(duì)保留時(shí)間(RRT)的重現(xiàn)性(n=5)

表6 特征峰積分相對(duì)比值(RA)的重現(xiàn)性(n=5)

表7 HPLC總面積測(cè)定結(jié)果

2.11 特征峰峰面積的比較

不同方法提取液12個(gè)特征峰峰面積見表8.

為便于比較，將不同方法提取液特征峰峰面積都除以SBEE液的特征峰峰面積，并求平均值，結(jié)果見表9.色譜圖見圖2～圖5.

表8 4種方法提取液指紋圖譜特征峰峰面積

表9 特征峰峰面積與SBEE液特征峰峰面積的比值

圖2 SBEE液HPLC指紋圖譜Fig. 2 Fingerprint of extract by SBEE for HPLC

圖3 SBE液HPLC指紋圖譜Fig. 3 Fingerprint of extract by SBE for HPLC

圖4 WE液HPLC指紋圖譜Fig. 4 Fingerprint of extract by WE for HPLC

圖5 AE液HPLC指紋圖譜Fig. 5 Fingerprint of extract by AE for HPLC

2.12 特征峰重疊率、檢出率、總差異率的比較

以SBEE提取液圖譜為標(biāo)準(zhǔn)圖譜，按下面公式分別計(jì)算不同方法提取液的共有峰重疊率、特征峰檢出率、總差異率，結(jié)果見表10.

式中：Aij—待測(cè)樣品中某個(gè)特征峰的面積；Aik—SBEE提取液中某個(gè)特征峰的面積；n—特征指紋峰的總數(shù).

表10 共有峰重疊率、檢出率、總差異率

2.13 相似度的比較[9]

以SBEE提取液圖譜為標(biāo)準(zhǔn)圖譜，利用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦值與歐氏距離測(cè)度方法，按下面公式分別計(jì)算不同方法提取液指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表11.

表11 4種方法提取液指紋圖譜相似度

3 討 論

文章對(duì)半夏白術(shù)天麻湯4種方法提取液進(jìn)行了HPLC指紋圖譜的比較，選取了12個(gè)特征峰進(jìn)行分析，4種方法提取液HPLC指紋圖譜的特征峰總面積大小順序?yàn)镾BEE>SBE>WE>AE.12個(gè)特征峰中7個(gè)以SBEE液的面積最大，初步說明，對(duì)于半夏白術(shù)天麻湯中具有324 nm紫外吸收的成分，SBEE液提取率優(yōu)于其他3種方法.

4種方法提取液共有峰重疊率和特征峰檢出率都為100%，而相似度和總差異率不同，表明4種提取液所含化學(xué)成分種類基本相同，但含量有差異.其中SBEE液與SBE液的色譜圖峰形非常相似，但總面積SBEE液大，說明SBEE與SBE法提取成分相近，效果SBEE法較SBE法為佳.

用相關(guān)系數(shù)、夾角余弦測(cè)度與歐氏距離測(cè)度方法檢測(cè)不同方法提取液的指紋圖譜與SBEE液的相似度，夾角余弦測(cè)度與相關(guān)系數(shù)測(cè)度的評(píng)價(jià)結(jié)果接近，相比較而言，夾角余弦測(cè)度法對(duì)于檢測(cè)指紋圖譜間譜峰比例關(guān)系的變動(dòng)較為適宜；歐氏距離測(cè)度法則具有較好的綜合評(píng)價(jià)能力，歐氏距離DE越大，其類間相似性越小，SBE液與SBEE液的歐氏距離最小，說明相似性最大.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3種測(cè)度結(jié)果一致，SBE液與SBEE液所含成分最相近，并且提取率僅次于SBEE液.

(鑒于知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題，暫不宜公開樣品液的制備部分.)

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