溫泉環(huán)境宏基因組文庫(kù)中醛脫氫酶基因的克隆及分析

諶 容,王秋巖,楊 兵,魏東芝,謝 恬*

(1.杭州師范大學(xué) 生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江 杭州 310012；2.生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華東理工大學(xué) 魯華生物技術(shù)研究所，上海 200237)

醛脫氫酶(ALDH)能催化脂肪族或芳香族醛類化合物的氧化，生成相應(yīng)酸的一類超家族，有寬的底物特異性.甲基丙二酸半醛脫氫酶(Methylmalonate semialdehyde dehydrogenase，EC 1.2.1.27，MMSDH)屬于醛脫氫酶超家族，催化丙二酸半醛或甲基丙二酸半醛的不可逆氧化脫羧，同時(shí)還原NAD+和合成乙?；虮?CoA[1].MMSDH是此家族中唯一的，因?yàn)榇朔磻?yīng)中必須需要CoA[2-3].在微生物和高等動(dòng)物中，MMSDH催化的反應(yīng)是纈氨酸和嘧啶分解代謝途徑的末端部分，許多研究表明，纈氨酸代謝為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和聚醚酸的形成提供脂肪酸前體起到了重要的作用[4].MMSDH由于耦合的醛脫氫酶活力和獨(dú)特的CoA酯類合成能力吸引了眾多研究者的興趣.從老鼠肝臟中純化的MMSDH有酯酶的活性，能水解p-硝基苯乙酸[5-6].來自芽孢桿菌[7]、天藍(lán)色鏈霉菌[8]、綠膿假單胞菌[9]的MMSDH等已經(jīng)有了較詳細(xì)的研究.

宏基因組(Metagenome)是由Handelsman等1998年提出的,它包含了比可培養(yǎng)微生物大得多的遺傳信息,其定義為生境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和.宏基因組技術(shù)將人們對(duì)微生物基因多樣性的認(rèn)識(shí)再次擴(kuò)大了上百倍[10].宏基因組中分離新基因主要通過基于酶活性的篩選和基于序列同源性的篩選兩種方法，各有優(yōu)劣[11].通過免培養(yǎng)-PCR技術(shù)成為替代的新酶發(fā)現(xiàn)策略[12].因此，為了獲得更多微生物的MMSDH信息，從溫泉宏基因組中采用免培養(yǎng)-PCR技術(shù)結(jié)合基因組步移技術(shù)從培養(yǎng)微生物宏基因組中進(jìn)行MMSDH基因的克隆與分析.

1 材料與方法

1.1 材 料

微生物樣本采集于廣西九曲溫泉水及水下的泥土，水溫為68 ℃.

1.2 試 劑

E.coliDH5α為該實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、Taq酶、克隆載體pMD19-T為TaKaRa公司產(chǎn)品.土壤DNA抽提試劑盒為Biovision公司產(chǎn)品，基因組步移試劑盒為Seegene公司產(chǎn)品.

1.3 方 法

1.3.1 宏基因組DNA的提取

取采集于溫泉下的土樣及水樣混合物，離心收集菌體，按照Power MaxTM Soil DNA Isolation Kit抽提宏基因組DNA.取1-2 μL DNA進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳分析，采用1%瓊脂糖凝膠，0.5*TBE緩沖液，電泳時(shí)間為16 h，脈沖時(shí)間10～25 s，脈沖角度為120°.

1.3.2 基于序列的醛脫氫酶引物的設(shè)計(jì)及保守序列的獲得

選擇450～520個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的醛脫氫酶，包含了Arg25和Gly414之間的區(qū)域，這些區(qū)域中包含了所有保守的未突變的殘基和保守片斷[3].根據(jù)10個(gè)保守模塊的氨基酸序列及PCR引物設(shè)計(jì)原則，最后選擇motif 4、motif 6和motif 10三個(gè)保守區(qū)域的氨基酸序列，結(jié)合核苷酸序列的保守性，保持引物的兼并度低于1024原則，最后設(shè)計(jì)引物，如表1所示.

表1 PCR及步移所用的引物序列

以宏基因組DNA為模板，采用引物分別進(jìn)行溫度梯度PCR，PCR體系為：10×Buffer 2 μL，dNTP 0.2 mmol，rTaq酶1U，模板4 μL，引物對(duì)Fm和Rm 2 μL，加去離子水至總反應(yīng)體積20 μL，PCR反應(yīng)條件為94 ℃，5 min； 94 ℃，30 s；40 ℃-50 ℃，45 s；72 ℃，40 s；30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)T載體克隆、測(cè)序.根據(jù)測(cè)序獲得的核苷酸序列與NCBI中進(jìn)行BLASTn和BLASTp分析.

1.3.3 基因組步移獲得全長(zhǎng)序列

根據(jù)獲得的保守序列，以及DNA Walking SpeedupTM Premix步移試劑盒的說明書并適當(dāng)改進(jìn)，分別設(shè)計(jì)3條引物，克隆保守序列的5′和3′端序列.PCR產(chǎn)物回收后經(jīng)T載體克隆、測(cè)序.獲得的序列與保守序列進(jìn)行電子拼接.第1次PCR反應(yīng)體系為：2*SeeAmpTMACPTM Master Mix Ⅱ 25 μL，dNTP，宏基因組DNA 1 μg，10 μM引物對(duì)(DW-ACP和TSP1)各1 μL，加去離子水至50 μL.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；42 ℃，1 min；72 ℃，2 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，100 s；20～30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.將PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為下一輪PCR的模板，引物為DW-ACPN和TSP2.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃-60 ℃，30 s；72 ℃，100 s；35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物稀釋50倍后作為下一輪PCR產(chǎn)物的模板，引物為Universal primer和TSP3，PCR反應(yīng)條件同上.將第2、3輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析和T載體克隆并測(cè)序.

1.3.4 新醛脫氫酶基因編碼蛋白質(zhì)的功能分析

使用Vector NTI 8.0軟件分析宏基因組來源的醛脫氫酶，推測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、理論分子量.DNA STAR軟件分析其啟動(dòng)子序列.采用Compute pI/MW工具分析其等電點(diǎn)(pI)(http://au.expasy.org/tools/pi_tool.html).BLASTp分析所獲得醛脫氫酶與其它醛脫氫酶的氨基酸序列的同源性(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)[13].基于SWISS-MODLE進(jìn)行蛋白質(zhì)三維建模[13]，進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的初步分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 宏基因組DNA的提取及檢測(cè)

采用Power MaxTM土壤DNA提取試劑盒成功提取宏基因組中的DNA，脈沖場(chǎng)電泳分析所獲得的宏基因組大小約40 Kb.

2.2 新的醛脫氫酶基因全長(zhǎng)的分離

采用溫度梯度PCR從宏基因組文庫(kù)中分離得到約700 bp左右的保守序列.經(jīng)分析，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的MMSDH有同源性.在保守序列的基礎(chǔ)上，根據(jù)DNA Walking SpeedupTM Premix Kit的原理和操作步驟，經(jīng)過3次步移，分別獲得了5′端和3′端的核苷酸序列.將所獲得的序列經(jīng)序列重疊群軟件分析，獲得1條完整的電子拼接序列.根據(jù)MMSDH的編碼區(qū)，設(shè)計(jì)引物，從宏基因DNA文庫(kù)中再次獲得全長(zhǎng)序列.

通過ORF finder分析醛脫氫酶的編碼序列，起始密碼子為GTG，終止密碼子為TGA.起始密碼子的上游序列有TAGGAG序列，推測(cè)為相似的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(圖1).推測(cè)編碼蛋白含有490個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為53.9kD，等電點(diǎn)為5.02.將推測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行Blastp分析發(fā)現(xiàn)，與Genbank庫(kù)中的來自于BacteriumEllin514的甲基丙二酸半醛脫氫酶序列相似性最高達(dá)到73%，序列一致性為53%.與其他微生物的甲基丙二酸半醛脫氫酶或乙醛脫氫酶具有不同程度的相似性.Blastp分析結(jié)果表明，筆者成功從宏基因組中分離到1條新的醛脫氫酶基因.

2.3 新醛脫氫酶基因編碼蛋白質(zhì)的分析

將獲得的推測(cè)的MMSDH氨基酸序列與已鑒定有功能的MMSDH序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明,一些重要的氨基酸殘基和模塊在這些序列中是保守的.醛脫氫酶家族重要的保守模塊在序列中均被發(fā)現(xiàn)[3].一些保守的Gly被認(rèn)為是非常重要的核酸結(jié)合區(qū)域及保守位點(diǎn).但是沒有發(fā)現(xiàn)典型的NAD+結(jié)合模塊(G-X-G-X-X-G).來源于Rattusnorvegicus的MMSDH在N端比微生物來源的MMSDH多一段信號(hào)肽序列，這與其定位于線粒體有關(guān)(rat liver mmsdh)，而微生物來源的MMSDH則沒有此段序列(圖2).推導(dǎo)的MMSDH的氨基酸序列與芽胞桿菌來源的MMSDH的相似性較高，達(dá)到了63%.將推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行SWISS-MODEL基于序列同源性的建模，模板為來自芽孢桿菌的MMSDH，最后獲得了推導(dǎo)的MMSDH三維結(jié)構(gòu)圖(圖3).推導(dǎo)的溫泉環(huán)境宏基因組來源的MMSDH三維結(jié)構(gòu)與芽孢桿菌的MMSDH三維結(jié)構(gòu)相似.MMSDH的10個(gè)保守motif位于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)部.

圖1 溫泉環(huán)境宏基因組中分離的MMSDH的核苷酸序列及其推測(cè)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MMSDH from hot spring metagenomic library

圖2 推測(cè)的宏基因組來源的MMSDH與其他物種MMSDH同源性比較Fig. 2 Multi-alignment of putative MMSDH and other MMSDHs Bacillus sp. ZP_01169178; Pseudomonas aeruginosa AAA25891; Streptomyces coelicolor AAA99190; Rattus norvegicus: AAA41638.

圖3 宏基因組來源的MMSDH與bacillus的MMSDH的三維結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig. 3 Comparison of 3-D structure between bacillus MMSDH and MMSDH from hot spring metagenomic library

3 結(jié)論與展望

采用兼并引物進(jìn)行免培養(yǎng)-PCR技術(shù)從真菌DNA中篩選新基因已有相關(guān)的報(bào)道，如成功獲得多條糖基水解酶家族基因[12]，Edwards等[14]采用PCR技術(shù)直接從森林土壤中分離出了多條纖維素基因部分序列.但是，這些研究并未獲得全長(zhǎng)基因序列.該研究結(jié)合DNA walking技術(shù)從宏基因組中成功分離到1條新的醛脫氫酶基因，為采用免培養(yǎng)-PCR技術(shù)方便快捷地分離基因提供了依據(jù).該研究證實(shí)了免培養(yǎng)-PCR在微生物基因研究中的價(jià)值，且新酶的篩選技術(shù)得到了發(fā)展.獲得的MMSDH基因進(jìn)一步進(jìn)行其獨(dú)特的酯類合成能力與酯酶活性分析，為研究微生物來源的MMSDH功能奠定基礎(chǔ).

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