黑胡椒抑菌活性物質提取工藝優(yōu)化

陳文學，胡月英，葛 暢，張 鑫，蔣志國，李從發(fā)

（海南大學食品學院，海南?？?70028）

黑胡椒抑菌活性物質提取工藝優(yōu)化

陳文學，胡月英，葛 暢，張 鑫，蔣志國，李從發(fā)*

（海南大學食品學院，海南?？?70028）

為了研究黑胡椒中抑菌活性物質的提取工藝，以黑曲霉做指示菌，以提取率×抑菌圈直徑為活性追蹤指標，在單因素實驗的基礎上通過二次回歸通用旋轉組合設計進行工藝參數(shù)優(yōu)化。結果表明，其最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80%，浸泡時間480min，提取時間100min。

黑胡椒，抑菌，黑曲霉

胡椒（Piper nigrum L.），藤本植物，屬胡椒科，由胡椒科植物的球形漿果干制加工而成，帶黑色果皮者稱為黑胡椒。1947年引入中國海南［1-2］，然后在廣東、云南、廣西、福建等省區(qū)也陸續(xù)引種試種成功。胡椒種植業(yè)現(xiàn)已作為海南省的一項產(chǎn)業(yè)，不僅基本滿足了國內市場對胡椒的需要并且還有部分出口［3］。胡椒在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)上具有很多用途，在食品工業(yè)中，胡椒是一種優(yōu)良的食品調味劑和食用香料［4］，并且具有防腐作用，被廣泛用作腌制品的防腐性香料；在醫(yī)藥工業(yè)上，它可提取胡椒堿，胡椒林堿，胡椒油堿甲、乙、丙等生物堿和揮發(fā)油，還可將其加入藥材使用，有鎮(zhèn)靜，溫中散寒、下氣、健胃、止痛、消炎、解毒、降血脂等功能［6-7］，可治療消化不良癥、寒痰、積食、腸炎、支氣管炎、感冒和風濕病等。胡椒在抗驚厥，殺蟲，抗癌等多方面存在活性［8］。近年來的研究表明［9-13］，黑胡椒中抗癌前體化合物畢澄茄素（多環(huán)氧木脂素類化合物）對于1，2-二甲基肼（一種結腸致癌物）所引起的結腸癌有抑制作用。胡椒的乙醇提取物對常見食品污染菌有較強的抑制作用；胡椒揮發(fā)油對動物和植物病菌、腐敗菌均有抑制效果。由此可見，從黑胡椒中提取抑菌活性物質作為天然無污染的食品防腐劑具有非常好的經(jīng)濟前景和研究前景。目前國內外學者對胡椒的抑菌作用已有部分研究，但國內關于這一方面的研究還較少，本文主要研究胡椒對黑曲霉的抑菌作用，并對黑胡椒中抑菌活性物質的提取工藝進行優(yōu)化，以期為進一步開發(fā)利用這一豐富的植物資源提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

黑胡椒 購自百佳匯超市中興店；黑曲霉菌種海南大學食品學院微生物實驗室提供；培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。

超聲波清洗機 廣州經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)明珠電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設計廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；生化培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠；電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；立式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將黑胡椒置于50～60℃非鼓風烘干1d，待冷卻后，粉碎，過40目篩，取篩下物留作樣品。

1.2.2 抑菌實驗方法 平板打孔法是固體平板擴散法的其中一種，可以在平板上打一定大小的圓孔，然后把被測物滴入孔內。經(jīng)培養(yǎng)后在物質擴散所及的范圍內出現(xiàn)抑菌圈（或生長圈），測量圈的直徑，即可知道被測物的抑菌能力［14］。每個平板中加入適量培養(yǎng)基，冷卻后加入0.3mL菌懸液［15］涂布均勻，然后用直徑為11mm的打孔器打孔，吸取0.1mL樣品溶液注入已打好的圓孔中（以95%乙醇為空白），于37℃下培養(yǎng)24h，測抑菌圈直徑。

抑菌圈直徑（mm）=樣品抑菌圈直徑-空白抑菌圈直徑

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 不同提取工藝對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響 在250mL三角瓶中加入5.000g樣品，然后加入100mL 95%乙醇，浸泡240min后分別用超聲波提取法和回流提取法［16］提取60min。提取結束后用真空泵抽濾，然后置于60℃水浴鍋中濃縮蒸干，冷卻后稱重并計算提取率。

1.2.3.2 溶劑濃度對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響 在250mL三角瓶中加入5.000g樣品，然后分別加入100mL 95%乙醇，80%乙醇，60%乙醇，40%乙醇，水，浸泡240min后黑胡椒用回流法提取60min。提取結束后用真空泵抽濾，然后置于60℃水浴鍋中濃縮蒸干，冷卻后備用。

1.2.3.3 提取時間對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響 在250mL三角瓶中加入5.000g樣品，然后加入100mL 95%乙醇100mL，浸泡240min后，用超聲波法提取，分別以20、40、60、80、100、120min提取。提取結束后用真空泵抽濾，然后置于60℃水浴鍋中濃縮蒸干，冷卻后備用。

1.2.3.4 浸泡時間對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響 在250mL三角瓶中加入5.000g樣品，然后加入100mL 95%乙醇100mL，分別浸泡0、240、480、720、960min，然后用超聲波法提取60min后用真空泵抽濾，然后置于60℃水浴鍋中濃縮蒸干，冷卻后備用。

1.2.4 黑胡椒抑菌活性物質的提取工藝參數(shù)優(yōu)化根據(jù)以上單因素實驗結果，分別將溶劑濃度、浸泡時間、提取時間對抑菌效果的綜合影響，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)設計三因素二次通用旋轉組合實驗設計，對黑胡椒進行工藝優(yōu)化。實驗結果分析均在DPS數(shù)據(jù)處理軟件下運行，編碼因子見表1。

表1 二次通用旋轉組合設計因子水平表

2 結果與分析

2.1 不同提取工藝對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響

不同提取工藝對提取效果及抑菌效果的影響如表2所示。經(jīng)過Duncan法比較發(fā)現(xiàn)，黑胡椒用回流法和超聲波法提取在提取率上無顯著性差異；在抑菌圈直徑上兩者存在顯著性差異，回流法的抑菌效果更好。通過比較兩者提取的提取率及抑菌圈直徑效果，故黑胡椒選擇用回流法提取。

表2 黑胡椒不同提取工藝的提取效果及抑菌效果

2.2 溶劑濃度對黑胡椒提取率及抑菌效果的影響

溶劑濃度對提取率及抑菌效果的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著溶劑濃度的逐漸增大，黑胡椒提取液提取率也隨之增大，當溶劑濃度增加到一定程度時，增加趨勢有所減緩；當乙醇濃度達到95%時，黑胡椒提取液抑菌效果最好。根據(jù)相似相溶原理，說明95%乙醇溶液較適合黑胡椒中抑菌物質的提取。

圖1 溶劑濃度對黑胡椒的提取率及抑菌效果的影響

2.3 提取時間對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響

提取時間對提取效果及抑菌效果的影響如圖2所示。由圖2可知，抑菌活性總體呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，當提取時間為60min時提取效果及抑菌效果均達到最佳。當提取時間小于60min時，回流處理時間較短暫，黑胡椒中提取物因溶劑效應有利于其溶解，并且隨著提取時間的延長，黑胡椒中的抑菌物質的提取率增大，所以抑菌活性也逐漸增大；而當時間超過60min時，回流處理時間較長，影響了抑菌物質的活性，對提取效果產(chǎn)生了波動，當提取時間為60～120min之間，在100min又出現(xiàn)一個峰值。

圖2 提取時間對黑胡椒的提取效果及抑菌效果的影響

2.4 浸泡時間對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響

浸泡時間對黑胡椒抑菌活性物質提取效果及抑菌效果的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著黑胡椒浸泡時間的延長，提取率總體呈遞增的趨勢，抑菌效果呈先增后減的趨勢，當浸泡時間在0～720min時，隨著時間的延長，黑胡椒中抑菌活性物質的提取因溶劑效應有利于其溶解，使抑菌效果在720min時達到最大值，抑菌圈直徑達到了6.96mm。但當時間超過720min時，由于乙醇隨時間的延長緩慢揮發(fā)或其他原因，使整個溶劑系統(tǒng)極性發(fā)生變化。所以抑菌效果呈下降趨勢。

圖3 不同浸泡時間對黑胡椒的提取效果及抑菌效果的影響

2.5 黑胡椒抑菌活性物質提取工藝參數(shù)及優(yōu)化

根據(jù)以上單因素實驗結果表明，溶劑濃度、浸泡時間、提取時間等對黑胡椒抑菌活性物質的提取均具有不同程度的影響。因此采用二次通用旋轉組合實驗設計對提取工藝進行了優(yōu)化，實驗結果見表3。實驗結果分析均在DPS數(shù)據(jù)處理軟件下運行。

表3 黑胡椒的二次通用旋轉組合設計方案及結果

采用DPS7.0及SAS8.2對黑胡椒對黑曲霉抑菌效果進行回歸分析得到以下回歸方程，實驗結果的方差分析見表4。其回歸方程如下：

對胡椒抑菌提取的數(shù)學模型進行方差分析，并對各因子的偏回歸系數(shù)進行檢驗，結果（表4）表明：一次項中X2的偏回歸系數(shù)顯著，說明浸泡時間對提取率×抑菌圈直徑效果有顯著影響；X1、X3的偏回歸系數(shù)極顯著，說明溶劑濃度、提取時間對提取率×抑菌圈直徑效果有極顯著影響；交互項的偏回歸系數(shù)X1X3顯著，說明溶劑濃度和提取時間的交互項對胡椒提取效果有顯著影響；二次項中的偏回歸系數(shù)達極顯著水平，其他各項的偏回歸系數(shù)均未達到顯著水平。

表4 黑胡椒活性提取物對黑曲霉抑菌效果的實驗結果方差分析

采用頻率分析法尋找最優(yōu)工藝。對數(shù)學回歸模型進行頻率分析得到的結果見表5，在95%的置信區(qū)間的優(yōu)化方案為：溶劑濃度81%～86%，浸泡時間367～512min，提取時間70～81min。

表5 優(yōu)化提取方案中Xi取值頻率分布

以提取率×抑菌圈直徑為準，將其回歸方程用LINGO語言進行分析，得到最佳方案為：乙醇濃度為80%，浸泡時間480min，提取時間100min。對最佳方案進行驗證，得到提取率×抑菌圈直徑為88.0516，與理論值的87.1148相差不大，所以可認為其為最佳方案。

3 結論

3.1 通過二次通用旋轉組合實驗設計建立了黑胡椒抑菌活性物質提取的溶劑濃度、浸泡時間、提取時間3個因素的回歸方程，此模型在實驗范圍內能較準確地預測黑胡椒抑菌活性物質的提取效果。

3.2 3個因素對白胡椒抑菌活性物質的提取效果的影響大小順序為：溶劑濃度＞提取時間＞浸泡時間。

3.3 通過二次通用旋轉組合實驗設計獲得了黑胡椒抑菌活性物質的最佳提取工藝參數(shù)為：黑胡椒用80%乙醇溶液提取，浸泡時間 480min，提取時間100min時對黑曲霉具有最佳的抑制效果。

3.4 大量研究表明，廣泛存在于植物中的酚酸類化合物具有抗細菌和抗真菌的性能［17］。K.J.Pradhan從青胡椒漿果中分離得到兩個酚類化合物，即3，4-二羥基苯乙醇葡萄糖苷及3，4-二羥基6（N-乙胺基）苯甲酰胺A、B兩種物質［18-19］，對傷寒沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌等有較強的抑制作用［20］。

本文是對黑胡椒抑菌活性物質的提取工藝進行了優(yōu)化，今后的研究中一方面采用HPLC/MS或者HPLC/MS/MS對黑胡椒提取物中主要的抑菌活性成分進行定性定量分析，另一方面加強對黑胡椒抑菌活性物質的應用研究，并且在進一步的分離純化的基礎上，將其應用到肉類的保鮮中去。胡椒經(jīng)乙醇提取后制成天然防腐劑，不僅可取代對人體健康有一定影響的化學合成防腐劑，而且對人體無害且有一定的醫(yī)療保健作用，同時還賦予食品獨特的香味，可滿足人們對天然食品、綠色食品、健康食品的需要。

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Optimization technology for extracting antibacterial substances from black pepper

CHEN Wen-xue，HU Yue-ying，GE Chang，ZHANG Xin，JIANG Zhi-guo，LI Cong-fa*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570028，China）

ln order to investigate the technology for extracting antibacterial substances from black pepper，Aspergillus niger was used as indicator bacteria，extraction rate and diameter of inhibition zone were used as the activity monitoring parameter.The optimum extraction conditions were obtained by quadratic general rotary unitized design.The results showed that the optimum extraction conditions were 80%ethyl alcohol as extraction，immersed 480min and extracting 100min.

black pepper；antibacterial activity；Aspergillus niger

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0279-04

2009-11-09 *通訊聯(lián)系人

陳文學（1968-），男，副教授，主要從事熱帶農產(chǎn)品加工的教學與科研工作。

十一五國家科技支撐項目（2007BAD76B04）；海南省自然科學基金（808102）；海南省教育廳基金（Hj2009-25）；海南大學?？萍蓟鹳Y助（hd09xm90）。