一種檢測麥芽蛋白質(zhì)溶解度的新方法

韓 丹，姜曉雷，孫麗華，莫新迎，陳 霞，趙長新，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.遼寧經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院，遼寧沈陽110122）

一種檢測麥芽蛋白質(zhì)溶解度的新方法

韓 丹1，姜曉雷1，孫麗華2，莫新迎1，陳 霞1，趙長新1，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.遼寧經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院，遼寧沈陽110122）

麥芽庫值是反映大麥蛋白質(zhì)溶解的重要指標(biāo)，只有溶解適度的麥芽才能釀制出高品質(zhì)的啤酒，因此麥芽蛋白質(zhì)溶解度的檢測尤為重要。EDTA是一種良好的金屬離子螯合劑，本文分別用不同濃度的EDTA水溶液培養(yǎng)大麥，利用EDTA、金屬離子和蛋白酶活性之間的關(guān)系，分析EDTA對蛋白酶活力和麥芽中各組分蛋白含量的影響、各蛋白組分之間的轉(zhuǎn)化及其與麥芽庫值的相關(guān)性，并以此為據(jù)建立檢測麥芽蛋白質(zhì)溶解度的新方法。

庫值，麥芽蛋白溶解度，EDTA，蛋白含量，SDS-PAGE電泳

庫爾巴哈值（下簡稱庫值）是麥芽蛋白溶解的一個重要指標(biāo)［1］。發(fā)芽時麥粒中蛋白質(zhì)的溶解是否適當(dāng)是決定麥芽和啤酒質(zhì)量的主要因素，如用溶解不足的麥芽釀造啤酒，其浸出物得率低，泡持性差，且易產(chǎn)生渾濁；如采用溶解過度的麥芽，則會引起酵母早衰，酒味淡薄。因此，正確把握麥芽蛋白質(zhì)溶解度對于保證啤酒品質(zhì)具有重要意義。傳統(tǒng)檢測麥芽蛋白溶解度的方法測定庫值，此法僅能從宏觀上反映蛋白質(zhì)的溶解程度，不能充分反映其溶解過程，且操作麻煩，因此建立簡便有效的檢測方法尤為重要。在大麥發(fā)芽過程中，蛋白質(zhì)的分解主要依靠蛋白酶，而蛋白酶活的發(fā)揮大多需要金屬離子參與。已有研究表明，大麥發(fā)芽過程中金屬離子對制麥酶系活力有明顯的激活作用。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）是一種金屬離子螯合劑，能與大部分金屬離子形成穩(wěn)定的水溶性螯合物。本論文根據(jù)金屬離子與大麥酶系的關(guān)系，利用EDTA與金屬離子的關(guān)系在浸麥時添加不同濃度的EDTA以去除金屬離子作用，從而抑制蛋白酶活性，改變其對蛋白質(zhì)的分解和麥芽蛋白含量，并通過檢測庫值掌握這些麥芽的蛋白質(zhì)溶解程度。同時根據(jù)Osborne的溶解度分類法［2-3］，分別提取這些麥芽的水溶、鹽溶、醇溶和堿溶蛋白，分析其SDS-PAGE電泳圖譜，從中找出各蛋白組分間的相互轉(zhuǎn)化及其與麥芽庫值的相關(guān)性，并以此聯(lián)系為依據(jù)建立檢測麥芽蛋白質(zhì)溶解度的新方法，為工業(yè)上評估和改良釀造大麥和麥芽質(zhì)量提供更簡便有效的判據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麥 Gairdner（澳大利亞），由大連中糧麥芽有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、丙烯酰胺、甘氨酸（Amresco）、SDS-PAGE低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（TaKala）；考馬斯亮藍(lán) R-250/G-250、干酪素、EDTA、95%乙醇、NaCl、NaOH等 均為國產(chǎn)分析純。

ZPS-250H智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 黑龍江東拓儀器制造有限公司；WFJ7200可見光分光光度計 尤尼柯儀器有限公司；YQ-PJ-6B型自動糖化器 輕工業(yè)部西安輕機所光電公司；GTL-16A離心機 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；JM-250型垂直板電泳儀 上海捷邁科貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 麥芽的制備 分別選取濃度為0.05%、0.10%和0.15%的EDTA水溶液培養(yǎng)大麥，并以水培養(yǎng)作為空白對照。采用浸水5h斷水10.5h，再浸水6h斷水3h的方式浸麥，使其最終浸麥度達(dá)到44%～47%，然后進(jìn)入發(fā)芽階段，控制溫度16℃、濕度90%以上，發(fā)芽96h后焙焦制成麥芽。分別取發(fā)芽0、24、48、72、96h的綠麥芽和焙焦后的成品麥芽樣品備用。

1.2.2 蛋白酶活力的測定 稱取擦干表面水的上述綠麥芽10g，粉碎后放入糖化杯內(nèi)，加入去離子水90mL、pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液10mL，于40℃水浴保溫攪拌1h后，2800r/min離心15min。最后得到的上清液用來測定蛋白酶活性。具體測定方法詳見參考文獻(xiàn)［4］。

1.2.3 蛋白的提取 水溶、鹽溶、醇溶和堿溶四種蛋白的提取方法詳見參考文獻(xiàn)［5］。

1.2.4 蛋白含量的測定 采用Bradford法，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，詳見參考文獻(xiàn)［6］。

1.2.5 SDS-PAGE電泳 按照 Laemmli的 SDSPAGE方法［7］，濃縮膠5%，分離膠12%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，醋酸-甲醇體系脫色。

1.2.6 麥芽指標(biāo)的測定 具體測定方法詳見《啤酒工業(yè)手冊》［8］。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度EDTA對大麥發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響

圖1 大麥發(fā)芽過程中蛋白酶活力的變化

由圖1可知，EDTA的加入對未萌發(fā)的大麥種子幾乎沒有影響，三種濃度下的蛋白酶活力與空白對照相差不大。發(fā)芽初期由于赤霉素的誘導(dǎo)，麥芽中各種酶的活力得到活化，如圖可見發(fā)芽24h后蛋白酶活力開始增長。部分蛋白酶需要有金屬離子的存在才能充分發(fā)揮其催化活性，尤其羧肽酶是一個含Zn2+的蛋白酶，Zn2+與酶結(jié)合在其活性部位。發(fā)芽24h后EDTA逐漸滲入麥芽內(nèi)部，開始螯合其中的金屬離子，于是大麥各蛋白酶中以金屬離子為活性中心組成部分或激活劑的羧肽酶等蛋白酶活力逐漸降低，因此由圖中可見，加入EDTA后的蛋白酶活力被部分抑制。EDTA添加濃度為0.10%和0.15%的大麥中蛋白酶活力增長速度較空白減慢。發(fā)芽48h后EDTA添加濃度為0.05%的大麥蛋白酶活力增長速度也開始減慢。發(fā)芽結(jié)束點96h時各麥芽中酶活力差異最大，且隨EDTA添加濃度的升高依次降低，分別為500.559、421.732、369.136U，均低于空白對照的589.061U。

2.2 不同濃度EDTA對麥芽庫值的影響

由圖2可見，在浸麥過程中加入不同濃度的EDTA可以降低麥芽的庫值，且加入的EDTA濃度越高庫值越低，大麥蛋白質(zhì)溶解越差。說明EDTA的添加對于大麥蛋白的溶解產(chǎn)生了抑制作用。

圖2 添加不同濃度EDTA對麥芽庫值的影響

2.3 不同濃度EDTA對麥芽蛋白含量的影響

由2.1研究可知，添加不同濃度EDTA抑制了大麥發(fā)芽過程中蛋白酶的活力，且在發(fā)芽結(jié)束時各麥芽中蛋白酶活力差異較大。于是取水、0.05%、0.10%和0.15%EDTA四種培養(yǎng)條件下的麥芽（其中水培養(yǎng)的作為空白），分別提取其水溶、鹽溶、醇溶和堿溶蛋白，并測定含量，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，EDTA的添加不同程度地改變了麥芽中四種蛋白的含量。

圖3 麥芽中水溶、鹽溶、醇溶和堿溶蛋白的含量

已有研究表明大麥發(fā)芽過程中貯藏蛋白不斷分解成可溶性蛋白，并被輸送到大麥胚部供根芽和葉芽生長，因此水溶蛋白和鹽溶蛋白的含量是不斷積累的，而作為貯藏蛋白的醇溶和堿溶蛋白含量的總體變化趨勢是降低的。從圖3可以看出，EDTA加入后明顯降低了麥芽中水溶和鹽溶蛋白的含量，且其含量均隨EDTA添加濃度的升高而降低，可見EDTA抑制了蛋白酶活力后進(jìn)一步影響了貯藏蛋白的分解，進(jìn)而影響了可溶性蛋白的積累。因此作為貯藏蛋白的醇溶蛋白和堿溶蛋白的分解受到了抑制，且其分解量均隨EDTA添加濃度的升高而降低，因此由圖3中可以看出添加EDTA后的麥芽中醇溶蛋白和堿溶蛋白含量均比空白高。

2.4 麥芽中各蛋白組分間的相互轉(zhuǎn)化及其與麥芽庫值的關(guān)系

大麥發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)的溶解受蛋白質(zhì)水解酶的控制。不同濃度EDTA的添加抑制了蛋白酶的活力，導(dǎo)致四種培養(yǎng)條件的麥芽中各蛋白含量和組分產(chǎn)生差別。分析上述現(xiàn)象的原因，EDTA是金屬離子螯合劑，而大麥蛋白酶中的羧肽酶是一種含Zn2+的蛋白酶。由此可以推斷，受EDTA影響而降低活力的蛋白質(zhì)水解酶主要為羧肽酶。運用SDS-PAGE電泳分析麥芽各蛋白組分，結(jié)果見圖4?？芍?，加入EDTA后，水溶和鹽溶蛋白中分子量約50.0kDa左右的蛋白條帶含量差異較大，且隨EDTA添加濃度的升高而降低。醇溶蛋白29.0～97.2kDa之間的蛋白條帶（尤其是 90.0kDa左右的蛋白）和堿溶蛋白90.0kDa和53.0kDa左右的蛋白條帶含量高于空白，說明其分解受到了抑制，且其分解量隨EDTA添加濃度的升高而降低，由此可知羧肽酶易作用于這些蛋白，并有固定的酶切割位點，切割后生成分子量約50.0kDa左右的蛋白，并最終轉(zhuǎn)移到水溶和鹽溶蛋白中。而切割后的部分未在電泳圖譜中體現(xiàn)，推測其可能在其他蛋白酶的作用下被分別轉(zhuǎn)移到其他組分中。

圖4 麥芽中水溶、鹽溶、醇溶和堿溶蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜

綜上所述，大麥醇溶蛋白29.0～97.2kDa之間的蛋白和堿溶蛋白約90.0kDa和53.0kDa左右的蛋白受羧肽酶活力影響較大，且隨EDTA添加濃度的升高其分解量降低，結(jié)合2.2中的研究可知麥芽的庫值隨EDTA添加濃度的升高而降低，由此可知上述蛋白被羧肽酶分解的越多，麥芽庫值越高。它們被分解后生成分子量約50.0kDa左右的蛋白，并不斷轉(zhuǎn)移到水溶和鹽溶蛋白中，結(jié)合圖4和圖2可知這條50.0kDa左右的蛋白條帶含量與麥芽庫值呈正相關(guān)，其含量積累的越高，麥芽庫值越高。

2.5 檢測麥芽蛋白質(zhì)溶解度的新方法

根據(jù)麥芽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)級麥芽溶解適度，庫值應(yīng)大于41%。本研究中0.10%EDTA水溶液培養(yǎng)的大麥所制麥芽庫值為41.4%，因此可以以此麥芽中水溶和鹽溶蛋白50.0kDa左右的蛋白條帶含量作為判定麥芽蛋白質(zhì)溶解適度的標(biāo)準(zhǔn)，衡量麥芽蛋白質(zhì)溶解程度及成品麥芽的品質(zhì)。運用凝膠分析軟件BandScan分析并計算出其含量分別為0.193mg/g和0.25mg/g。

由此可知，當(dāng)麥芽水溶和鹽溶蛋白50.0kDa左右的蛋白條帶含量分別達(dá)到0.193mg/g和0.25mg/g以上時，相應(yīng)的麥芽醇溶和堿溶蛋白易受羧肽酶影響的組分分解較好，麥芽溶解較好，品質(zhì)較高。此方法比起工業(yè)上通過測定協(xié)定糖化麥汁中可溶氮與總氮含量計算出成品麥芽庫值的方法簡便很多。

3 結(jié)論

為了探尋可以替代檢測庫值的判定麥芽蛋白質(zhì)溶解度的新方法，本文根據(jù)EDTA、金屬離子及蛋白酶活力相互間的特殊關(guān)系，分別用不同濃度的EDTA水溶液培養(yǎng)大麥。結(jié)果表明，EDTA可以通過螯合維持蛋白酶活力所必須的金屬離子降低麥芽中蛋白酶的活力，主要降低羧肽酶活力；抑制大麥發(fā)芽過程中蛋白的溶解，降低麥芽庫值；減少高分子貯藏蛋白向可溶性蛋白的轉(zhuǎn)化，改變麥芽中水溶、鹽溶、醇溶和堿溶蛋白的含量。

運用SDS-PAGE電泳分析麥芽中四種蛋白，發(fā)現(xiàn)大麥醇溶蛋白29.0～97.2kDa之間的蛋白和堿溶蛋白90.0kDa和53.0kDa左右的蛋白受羧肽酶活力影響較大，它們被羧肽酶分解后生成分子量約50.0kDa左右的蛋白，并轉(zhuǎn)移到水溶和鹽溶蛋白中。當(dāng)EDTA加入后，Zn2+被螯合，羧肽酶活力降低，醇溶和堿溶蛋白中易被作用組分分解受到抑制，最終導(dǎo)致水溶和鹽溶蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜中50.0kDa左右的蛋白積累含量減少，麥芽庫值降低，蛋白溶解受到抑制。由此可知，麥芽水溶和鹽溶蛋白中50.0kDa左右的蛋白條帶含量與麥芽蛋白質(zhì)溶解程度呈正相關(guān)性，因此可以以其含量作為判定麥芽蛋白溶解適度的標(biāo)準(zhǔn)。運用凝膠分析軟件BandScan分析此條帶并計算其含量，結(jié)果表明當(dāng)其在水溶和鹽溶蛋白中含量分別達(dá)到0.193mg/g和0.25mg/g以上時，醇溶蛋白和堿溶蛋白中受羧肽酶影響較大的蛋白組分分解較好，麥芽溶解較好，品質(zhì)較高。因此可以以此為依據(jù)建立檢測麥芽蛋白質(zhì)溶解程度的新方法。傳統(tǒng)依靠檢測麥芽庫值來反映蛋白溶解度的方法僅能從宏觀上反映出蛋白質(zhì)溶解的程度，而本研究的方法可從微觀上反映出麥粒內(nèi)部各蛋白之間的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系及蛋白溶解過程，且操作上相對簡單方便，對于深入研究大麥蛋白溶解理論、工業(yè)上評判麥芽質(zhì)量和保證啤酒品質(zhì)有著新的指導(dǎo)意義。

［1］Kunze W.啤酒工藝實用技術(shù)（第八版）［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2008：145-146.

［2］Osborne T B.The proteins of barley［J］.American Chemical Society journal，1895，17：539-567.

［3］Osborne T B.The Vegetable Proteins［M］.New York：Longmans Green and Co，1924.

［4］日本醬油研究所.醬油實驗法［M］.東京：日本醬油研究所出版，1985：294-298.

［5］Doll H，Andersen B.Preparation of barley storage protein，hordein for analytical sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis［J］.Analytical Biochemistry，1981，115：61-66.

［6］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248-254.

［7］Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227：680-685.

［8］管敦儀.啤酒工業(yè)手冊（修訂版）［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1996.

A new method on detecting malt protein solution

HAN Dan1，JIANG Xiao-lei1，SUN Li-hua2，MO Xin-ying1，CHEN Xia1，ZHAO Chang-xin1，*
（1.Dalian Polytechnic University College Malting Buckwheat of Biology and Food Technology，Dalian 116034，China；2.Liaoning Economic management Cadre College，Shenyang 110122，China）

Malt Kolbach index is an important target on reflecting barley protein solution.Only the malts dissolved moderately could brew high quality beer，so the detection of malt protein solution is the most important.EDTA is a kind of good metal ions chelating agent.Different concentrations EDTA aqueous solution were used to culture barley，and the barleys which were cultured with water were used to make a contrast.ln this article，the influences of EDTA on protease activity and protein content in malts，the transition among the different protein ingredients and the relation to malt Kolbach index were analysed，new method on detecting malt protein solution was built basing on the results above.

Kolbach index；solution of malt protein；EDTA；protein content；SDS-PAGE

TS210.7

A

1002-0306（2010）11-0356-04

2010-01-14 *通訊聯(lián)系人

韓丹（1984-），女，碩士研究生，研究方向：制麥、大麥生理及大麥蛋白。

國家科技部“十一五”科技支撐項目（2007BAK36B01）。