解脂酵母中POX3基因的敲除研究

師慧敏，王 芳，黃 琳，劉常金，*，張治洲，2，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457；2.哈爾濱工業(yè)大學（威海）科學與工業(yè)技術(shù)研究院，山東威海246209）

解脂酵母中POX3基因的敲除研究

師慧敏1，王 芳1，黃 琳1，劉常金1，*，張治洲1，2，*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457；2.哈爾濱工業(yè)大學（威海）科學與工業(yè)技術(shù)研究院，山東威海246209）

對耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中編碼與γ-癸內(nèi)酯合成相關(guān)的乙酰輔酶A氧化酶基因（P0X1-P0X5）中的P0X3基因用Cre/loxP同源重組系統(tǒng)進行敲除。設(shè)計含有60個核苷酸與P0X3基因的ORF兩側(cè)序列同源的長引物，以pUG6為模板構(gòu)建帶有l(wèi)oxP-KanMX-loxP系統(tǒng)的敲除組件，之后轉(zhuǎn)化耶氏酵母，通過PCR確定陽性克隆子。將質(zhì)粒pSH65轉(zhuǎn)入陽性克隆子，半乳糖誘導(dǎo)表達Cre酶以切除KanMX基因。最后在YPD培養(yǎng)基中傳代丟失pSH65質(zhì)粒，獲得P0X3缺陷型菌株。由于在解脂酵母中表達生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯直接牽扯到若干個需要抑制的基因，單獨缺失其中的一個基因理論上可能實現(xiàn)不了產(chǎn)量的極大值。本研究為進一步構(gòu)建組合敲除準備了條件。

耶氏酵母，P0X3基因，基因敲除，Cre/loxP系統(tǒng)，γ-癸內(nèi)酯

γ-癸內(nèi)酯（gamma-decalactone，GDL）是一種重要的食品香料，廣泛地存在于水果、肉制品和日常食品中，它以其誘人的桃香和低香氣閾值的特性而在香料工業(yè)中普遍應(yīng)用［1］。耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是生物法生產(chǎn) GDL的主要酵母菌［2-3］，它以C18蓖麻油酸為底物經(jīng)過β-氧化使碳鏈縮短，再內(nèi)酯化成C10的GDL。乙酰輔酶A氧化酶是β氧化過程的重要酶，耶氏酵母菌中含有由至少五個不同乙酰輔酶A氧化酶組成的酶體系（Aox 1～5）。POX1～POX5為對應(yīng)的編碼Aox 1～5這五個乙酰輔酶A氧化酶的一組基因［4］，其中Aox1作用不詳，Aox2可促進C18蓖麻油酸經(jīng)β氧化為C10的GDL過程，Aox3～Aox5則對生成其他C10的產(chǎn)物（包括2-癸烯、3-羥基癸內(nèi)酯和3-癸烯）和γ-癸內(nèi)酯的降解過程有不同程度的促進作用［2］。以PCR為基礎(chǔ)的基因敲除方法，尤其是loxP-Marker-loxP序列組件和Cre/loxP系統(tǒng)的應(yīng)用是一種快速、準確的基因敲除手段［5］。黃建忠研究組在釀酒酵母乙醇脫氫酶研究上使用了loxPMarker-loxP序列組件和Cre/loxP系統(tǒng)成功敲除了ADH3、ADH2和SFA1雙倍體缺陷菌株，來影響釀酒酵母的乙醇代謝［6-8］。肖冬光研究組利用Cre/loxP系統(tǒng)成功敲除了面包酵母酸性海藻糖酶基因［9］。本文利用上述遺傳操作系統(tǒng)進行同源重組敲除POX3基因，切斷消耗γ-癸內(nèi)酯的一條支路，試圖使耶氏酵母生產(chǎn)GDL的產(chǎn)量提高。本研究的后續(xù)內(nèi)容是進行POX系列基因的組合缺失，甚至包括其他基因的組合缺失，以期考察GDL產(chǎn)量提高的潛力極限。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解脂耶羅威亞酵母出發(fā)菌（Yarrowia lipolytica）

上海愛普香料有限公司提供；質(zhì)粒pUG6、pSH65福建師范大學黃建忠教授惠贈，質(zhì)粒圖譜見圖1［8，10］；DNA Marker 北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司；培養(yǎng)基和細胞轉(zhuǎn)化試劑 北京普博欣生物科技有限公司；PCR試劑 北京博邁德科技發(fā)展有限公司；其他試劑 全部購自上海生工。

BIO-RAD MyCycler 170-9703型基因擴增儀、BIO-RAD170-8026型凝膠呈像儀 美國Biometra公司；SpeedCycler基因擴增儀 德國耶拿公司；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、XW-80A微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；Molecular/1015c型超純水機上海摩勒生物科技有限公司；LQP-B-型制冰機 上海安亭科學儀器制造廠；實驗耗材 全部購自上海生工。

表1 POX3基因敲除組件引物序列信息

圖1 pUG6質(zhì)粒簡圖（A）和pSH65質(zhì)粒簡圖（B）

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計 依據(jù)圖2所示的引物設(shè)計原則，設(shè)計三對引物。引物L1-R1是POX3基因敲除組件擴增引物；DL1-DR1、DL2-DR2是POX3的鑒定引物。L1和R1分別具有60bp與POX3基因外側(cè)同源的序列，另外20bp是與loxP兩端同源的序列。DL1，DR2位于POX3序列內(nèi)，DR1和DL2則位于loxP兩端。DL1不僅可以與DR1配對，還可以與DR2配對使用，用于敲除POX3基因之后的鑒定。具體引物信息見表1。

圖2 引物設(shè)計原則

1.2.2 基因敲除的基本流程 依據(jù)Cre/loxP基因敲除系統(tǒng)［10-11］，以質(zhì)粒pUG6作為模板，使用POX3基因敲除組件擴增引物進行PCR得到POX3基因敲除組件，并轉(zhuǎn)化解脂耶羅威亞酵母。再將質(zhì)粒pSH65轉(zhuǎn)化陽性克隆子，2%半乳糖誘導(dǎo)表達產(chǎn)生Cre酶切除KanMX基因，最后在YPD培養(yǎng)基中誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65丟失。得到POX3基因缺陷型菌株。

1.2.3 解脂酵母基因組DNA的提取 將一80℃保藏的解脂酵母菌種在YPD瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落接于50mL YPD培養(yǎng)基，30℃搖瓶培養(yǎng)24h，提取基因組DNA［12］，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 POX3基因敲除組件的構(gòu)建 以pUG6質(zhì)粒DNA為模板，用引物L1和R1進行PCR合成POX3基因敲除組件，PCR條件為：第一步：94℃預(yù)熱4min；第二步：包括30個循環(huán)，每個循環(huán)包括：94℃變性30s，60℃退火40s；72℃延伸2min；第三步：72℃延伸10min。50μL反應(yīng)體系中各個組分添加量：dNTP（2.5μmol/L），5μL；上游引物（2μmol/L），5μL；下游引物（2μmol/L），5μL；10×PCR Buffer，5μL；模板DNA（pUG6質(zhì)粒基因組DNA，10ng/μL），0.5μL；Taq（5U），1μL；其余用I級滅菌水補足到50μL。擴增產(chǎn)物（1.7kb）做瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后切膠回收。

1.2.5 POX3基因敲除組件的轉(zhuǎn)化 制備酵母菌感受態(tài)細胞，使用醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化POX3基因敲除組件到感受態(tài)解脂酵母中［13-14］。

1.2.6 陽性克隆子的篩選 轉(zhuǎn)化后的菌液涂在含有400mg/mL G418的YPD平板上，30℃培養(yǎng)3～5d，挑選在G418平板生長的陽性克隆子。

1.2.7 陽性克隆子的驗證 挑取陽性克隆子接種含有400mg/mL G418的YPD液體培養(yǎng)基中，30℃、搖床培養(yǎng)24～36h獲得菌體并提取菌體基因組DNA作為PCR驗證的模板。使用引物L1-R1進行初次PCR驗證。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4min，（94℃ 30s，45℃ 40s，72℃ 1min）×30個循環(huán)，72℃ 10min。使用鑒定引物DL1-DR1，DL2-DR2進行第二次PCR驗證，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4min，（94℃ 30s，43℃40s，72℃ 1min）×35個循環(huán)，72℃ 10min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.8 篩選標記的切除 將pSH65質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PCR驗證正確的陽性克隆子中，并在含有2%半乳糖的液體培養(yǎng)基YPG（YPD培養(yǎng)基中的葡萄糖改為半乳糖即為YPG）中誘導(dǎo)培養(yǎng)2～3d，取適量涂布在YPD平板上，30℃培養(yǎng)3d［6-10］。將得到的單菌落影印到含有G418（400mg/mL）的YPD平板中，篩選KanMX抗性標記丟失的菌株。將菌株在YPD培養(yǎng)基傳代5～10次，誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65丟失，獲得POX3基因缺陷菌株。液體培養(yǎng)菌體提取基因組DNA，使用鑒定引物進行PCR。PCR條件為：第一步：94℃預(yù)熱4min；第二步：包括30個循環(huán)，每個循環(huán)包括：94℃變性30s，40～60℃退火40s；72℃延伸2min；第三步：72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳檢測。

1.2.9 突變株生長曲線的測定 接種原始出發(fā)菌株和POX3基因缺失突變株于50mL種子培養(yǎng)基中，28℃，200r/min培養(yǎng)16～18h，每隔2h取樣檢測A600值，做三批平行實驗，取其平均值繪制生長曲線進行對比。

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)建POX3基因敲除組件

以提取的解脂酵母基因組DNA為模板，使用引物DL1-DR2進行PCR，得到大小與目的基因相符的擴增條帶，證明了基因組中POX3基因的存在。瓊脂糖凝膠電泳分析見圖3A。以質(zhì)粒pUG6為模板，使用引物L1-R1進行PCR得到POX3基因敲除組件。如圖3B所示，在100～500bp之間出現(xiàn)多余的兩條帶可能是80nt長引物帶來的非特異性產(chǎn)物。

圖3 POX3基因組DNA（A）以及POX3基因敲除組件（B）電泳圖

2.2 陽性克隆子的篩選

將驗證正確的基因敲除組件PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到酵母細胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有400μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3d后G418平板出現(xiàn)生長較為明顯的轉(zhuǎn)化子（圖4）。經(jīng)初步計算，在本實驗中500ngDNA轉(zhuǎn)化后大概可以得到幾十到200個左右的轉(zhuǎn)化子。挑取G418平板上生長明顯的克隆子，液體培養(yǎng)離心后獲得濕菌體，提取基因組DNA為模板，使用引物DL1-DR1，DL2-DR2和引物L1-R1進行PCR驗證，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，均可得到與預(yù)期值大小相符的條帶（圖5），證明基因敲除序列組件已經(jīng)正確整合到POX3的基因組中。

圖4 POX3轉(zhuǎn)化子菌落圖

2.3 G418抗性基因的切除

將帶有Cre重組酶的質(zhì)粒pSH65轉(zhuǎn)入陽性克隆子中，半乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生Cre酶切除KanMX基因，使細胞失去G418抗性。篩選抗性丟失的細胞，液體培養(yǎng)提取基因組DNA為模板，分別使用引物L1-R1和DL1-DR2進行PCR驗證，擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析，可得到大小為194bp和781bp的目的條帶，證明KanMX基因已經(jīng)被正確切除（圖6）。挑取連續(xù)傳代后的菌株在Zeocin平板上重新劃線檢測，如果不再生長，證明質(zhì)粒pSH65已經(jīng)丟失。

圖5 POX3轉(zhuǎn)化子PCR驗證電泳圖

圖6 PCR驗證KanMX基因的切除

2.4 突變株生長曲線測定

為檢測POX3基因敲除對菌株的生長狀態(tài)和菌體產(chǎn)量有無影響，分別對原始出發(fā)菌株和基因缺失突變株做生長曲線測定（圖7）。由生長曲線可以看到，與原始出發(fā)菌株相比，POX3基因敲除后的菌株無論在生長速率還是在菌體產(chǎn)量上，都沒有顯著差異。表明POX3基因的缺失對菌體的生長沒有造成太大影響。

圖7 菌株生長曲線圖

3 結(jié)論

本課題利用Cre/loxp系統(tǒng)，以pUG6質(zhì)粒為模板，使用長引物通過PCR構(gòu)建了解脂酵母POX3的線性敲除組件，并在此基礎(chǔ)上成功敲除了POX3基因。這種方法簡單易行，能在基本不影響其他基因的情況下實現(xiàn)目的基因的準確敲除［15］。目前國內(nèi)在解脂酵母中運用此技術(shù)的報道不多。由于在解脂酵母中表達生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯直接牽扯到若干個需要抑制的基因［2-4］，單獨缺失其中的一個基因理論上可能實現(xiàn)不了產(chǎn)量的極大值。POX3基因的敲除為進一步構(gòu)建組合敲除準備了條件。當然Cre/loxP系統(tǒng)在敲除多個基因時可能會遇到問題，因為每次會留下一個loxP位點，為后續(xù)的重復(fù)操作帶來一定的隱患，需要在基因組學分析的基礎(chǔ)上優(yōu)化設(shè)計，相關(guān)研究有待于進一步開展。

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Deletion of POX3 gene from Yarrowia lipolytica

SHI Hui-min1，WANG Fang1，HUANG Lin1，LIU Chang-jin1，*，ZHANG Zhi-zhou1，2，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Institute of Science and Industry Technology，Harbin Institute of Technology，Weihai 246209，China）

The POX3 gene could encode acyl-coenzyme A oxidase（acyl-CoA）in Yarrowia lipolytica and get involved in biosynthesis of γ-decalactone.POX3 knockout was mediated with a loxP-KanMX-loxP cassette centered in a PCR fragment employing 80bp primer pairs in which 60 nucleotides fully match the POX3 openreading frame.After transformed the linear disruption cassette into Yarrowia lipolytica cells，selected transformants were checked by PCR for correct integration and deletion of the target sequence.The KanMX marker was efficiently removed by transforming pSH65 plasmid and inducing the Cre expression.pSH65 was then lost after continually incubated in YPD.At last，the knockout mutant of POX3 gene was generated.The research provides a basis for combination knockouts of other genes that inhibit γ-decalactone production.

Yarrowia lipolytica；POX3；gene knockout；Cre/loxP；γ-decalactone

Q789

A

1002-0306（2010）11-0232-04

2009-12-04 *通訊聯(lián)系人

師慧敏（1984-），女，在讀碩士，研究方向：生物化學與分子生物學。