四氫嘧啶提高脂肪酶催化合成油酸乙酯產(chǎn)率的研究

王 越，張苓花

（1.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116026；2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

四氫嘧啶提高脂肪酶催化合成油酸乙酯產(chǎn)率的研究

王 越1，2，張苓花1

（1.大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧大連116026；2.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

為了對抗乙醇對酶的競爭性抑制作用，提高酶法合成油酸乙酯的酯化率，在米曲霉DM-01全細(xì)胞脂肪酶催化合成油酸乙酯的無溶劑體系中添加補(bǔ)償性溶質(zhì)。結(jié)果表明，添加補(bǔ)償性溶質(zhì)四氫嘧啶效果最好，四氫嘧啶濃度為1.5mmol/L時(shí)，0.1g全細(xì)胞脂肪酶催化油酸乙酯酯化合成反應(yīng)48h，油酸乙酯酯化率為61.4%，與未添加四氫嘧啶的相比，提高了24.8%，酯化速率提高了38.0%。在全細(xì)胞脂肪酶3次重復(fù)使用反應(yīng)中添加四氫嘧啶，與未加四氫嘧啶的比較，油酸乙酯相對酯化率分別提高了24.7%、33.3%和166.8%。添加四氫嘧啶為提高酶法合成油酸乙酯的產(chǎn)率提供了一種新手段。

四氫嘧啶，油酸乙酯，脂肪酶，無溶劑體系

油酸乙酯是高級脂肪酸醇酯，被廣泛用于化工和食品添加劑、特殊甘油三酯制備和柴油的添加劑等領(lǐng)域［1-2］。目前工業(yè)中主要采取十二烷基苯磺酸液體酸催化油酸和乙醇酯化生成，但需要在高溫、高壓及強(qiáng)酸條件下進(jìn)行，副反應(yīng)多，生產(chǎn)成本高［3-4］。為解決上述問題，人們研究利用脂肪酶催化油酸和乙醇進(jìn)行酯化反應(yīng)，制備油酸乙酯［5-6］。生物酶法制備油酸乙酯目前存在著一些亟待解決的問題，如底物乙醇影響酶反應(yīng)活性及穩(wěn)定性，酶價(jià)格高等，這些問題制約著生物酶法在工業(yè)中酯化反應(yīng)的應(yīng)用［5，7］。為降低乙醇對酶的抑制作用，以下幾種方法被報(bào)道：a.構(gòu)建逆膠束體系［8］；b.添加介質(zhì)［5］；c.利用固定化脂肪酶［6］；d.添加保護(hù)劑［9-11］。然而，至今尚未見到通過添加補(bǔ)償性溶質(zhì)提高油酸乙酯合成體系中脂肪酶活性和穩(wěn)定性的報(bào)道。四氫嘧啶（1，4，5，6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文名為ectoine，（結(jié)構(gòu)式見圖1［12］）是由嗜鹽菌在高滲透壓誘導(dǎo)下合成的一種滲透壓補(bǔ)償溶質(zhì)，有兩性離子性質(zhì)［14］。研究表明，四氫嘧啶對蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞等在逆環(huán)境下具有保護(hù)作用［12，14-16］。本文采用從白酒曲中篩選出來的米曲霉DM-01（Aspergillus oryzae DM-01）全細(xì)胞脂肪酶為催化劑，研究滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)四氫嘧啶對全細(xì)胞脂肪酶酯化合成油酸乙酯的影響，對于提高酶法酯化合成油酸乙酯的產(chǎn)率具有意義。

圖1 四氫嘧啶結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

產(chǎn)酶菌株 實(shí)驗(yàn)室篩選的菌株米曲霉DM-01（Aspergillus oryzae DM-01）；化學(xué)試劑 四氫嘧啶按文獻(xiàn)［17］方法制備；油酸、無水乙醇、氫氧化鈉 分析純；斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯-2%蔗糖培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基（L） 蛋白胨40g，蔗糖5g，橄欖油5g，硫酸銨1g，硫酸鎂1g，磷酸氫二鉀1g。

LGJ-10冷凍干燥機(jī) 寧波；METTLER TOLEDO電子分析天平 瑞士；ZHWY恒溫培養(yǎng)搖床 上海。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酶的制備 菌種米曲霉DM-01在斜面培養(yǎng)基30℃條件下培養(yǎng)3d，用無菌去離子水洗下孢子。1mL孢子懸浮液接到200mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（500mL三角瓶），在 30℃、120r/min條件下發(fā)酵48h。經(jīng)三層紗布過濾發(fā)酵液，收集菌絲體，用0.025mol/L、pH7.5磷酸緩沖液洗去發(fā)酵殘留物，在冷凍干燥機(jī)凍干48h。研缽磨碎，干燥儲存?zhèn)溆茫?8］。脂肪酶水解活性為89.9U/g，1U定義為40℃，pH7.5，1min水解乳化橄欖油產(chǎn)生1μmol脂肪酸所消耗的酶量。

1.2.2 酯合成 將10g油酸和無水乙醇（酸醇比因?qū)嶒?yàn)需要設(shè)定）置于50mL聚丙烯材料帶蓋離心管中，混合均勻，加入1%（w/w）米曲霉DM-01全細(xì)胞脂肪酶，在30℃、150r/min條件下振蕩反應(yīng)，定時(shí)取出反應(yīng)液，用于油酸乙酯酯化率測定。為研究重復(fù)使用全細(xì)胞脂肪酶對油酸乙酯酯化率的影響，脂肪酶從反應(yīng)體系中過濾分離，室溫下風(fēng)干，重新加入油酸和無水乙醇，反應(yīng)48h為一個周期。

1.2.3 酯化率的測定

1.2.3.1 酯化過程酯化率的測定 按照文獻(xiàn)［19］進(jìn)行。油酸乙酯的酯化率定義為反應(yīng)液中油酸酯化反應(yīng)消耗的質(zhì)量占反應(yīng)前油酸質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)（%），計(jì)算公式如下：

式中，V0-樣品反應(yīng)前用0.1mol/L氫氧化鈉滴定的耗堿量，mL；V-樣品反應(yīng)后用0.1mol/L氫氧化鈉滴定的耗堿量，mL。

1.2.3.2 相對酯化率 為重復(fù)使用全細(xì)胞脂肪酶催化合成油酸乙酯時(shí)，以第一次循環(huán)所合成的油酸乙酯酯化率為100%。

1.2.3.3 油酸乙酯酯化速率 單位時(shí)間油酸消耗的毫摩爾數(shù)（mmol/h），計(jì)算公式如下：

式中：M油酸-油酸起始摩爾數(shù)，30mmol；t-反應(yīng)時(shí)間，h。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸醇比對酯化率的影響

考察了在無溶劑體系中油酸和乙醇摩爾比對油酸乙酯酯化率的影響，按照方法“1.2.2”在酸醇比為2∶1～1∶5合成反應(yīng)體系中加入1%全細(xì)胞脂肪酶，反應(yīng)48h，測定油酸乙酯酯化率，結(jié)果見圖2。

圖2 酸醇摩爾比對酯化率的影響

由圖2可見，在高酸醇比時(shí)，酯化率隨著酸醇摩爾比降低而增高，說明增大乙醇的用量有利于合成反應(yīng)向生成油酸乙酯的方向移動。酯化率在酸醇摩爾比為1∶1時(shí)最大，達(dá)到50.4%。但乙醇量繼續(xù)增加，酯化率呈明顯下降趨勢。從理論上來講，1mol油酸完全酯化為相應(yīng)的油酸乙酯至少需要1mol乙醇，本文當(dāng)酸醇摩爾比超過1∶1時(shí)，乙醇便對脂肪酶活性造成抑制作用，因此下面實(shí)驗(yàn)的酸醇比均為1∶1。

2.2 添加滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)對油酸乙酯酯化合成的影響

為比較幾種滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)對全細(xì)胞脂肪酶催化合成油酸乙酯的影響，按照反應(yīng)體系體積1.5mmol/L的比例，將四氫嘧啶、海藻糖、甜菜堿和羥脯氨酸先溶解在乙醇中，按照方法“1.2.2”在油酸中加入溶有補(bǔ)償性溶質(zhì)的乙醇以及全細(xì)胞脂肪酶，反應(yīng)48h，測定油酸乙酯酯化率。結(jié)果見圖3。

圖3 滲透壓補(bǔ)償性溶質(zhì)對油酸乙酯酯化率的影響

由圖3可以看出，四氫嘧啶、甜菜堿和羥脯氨酸都對全細(xì)胞脂肪酶催化合成油酸乙酯具有保護(hù)作用，和無保護(hù)劑比較，對應(yīng)的油酸乙酯酯化率分別提高了24.8%、14.3%和14.3%。保護(hù)效果最好的是四氫嘧啶，其次是甜菜堿和羥脯氨酸，海藻糖對全細(xì)胞脂肪酶催化酯化合成油酸乙酯的保護(hù)效果不顯著。

在脂肪酶催化酯化合成油酸乙酯的無溶劑體系中，作為底物的乙醇在一定濃度下對脂肪酶具有兩個水平上的負(fù)面作用：一方面乙醇分子和酶結(jié)合會直接生成死端復(fù)合物，因此乙醇表現(xiàn)為動力學(xué)水平上的競爭性抑制［20］；另一方面，乙醇作為蛋白質(zhì)的變性劑引起酶蛋白天然構(gòu)象的破壞，導(dǎo)致脂肪酶的不可逆失活［21］。在油酸乙酯酯化合成體系中添加四氫嘧啶，能顯著地改善油酸乙酯酯化率。推測四氫嘧啶改善油酸乙酯酯化率是因?yàn)樗臍溧奏σ掖辑h(huán)境中的脂肪酶的保護(hù)作用，即四氫嘧啶一方面降低了乙醇對脂肪酶的競爭性抑制；另一方面提高了乙醇環(huán)境下酶蛋白天然構(gòu)象的穩(wěn)定性，減少了酶的不可逆失活。根據(jù)圖1的四氫嘧啶結(jié)構(gòu)，推測其可能在反應(yīng)體系中與酶以氫鍵結(jié)合，排阻并代替了部分乙醇與酶的結(jié)合，減少了酶分子與乙醇生成的死端復(fù)合物，從而提高了反應(yīng)速率；同時(shí)四氫嘧啶與酶的結(jié)合，增加了酶結(jié)構(gòu)“柔性”，從而增加了酶在乙醇環(huán)境中的穩(wěn)定性。

2.3 四氫嘧啶添加量對油酸乙酯酯化合成的影響

考察添加四氫嘧啶對無溶劑體系中油酸乙酯酯化率的影響，按照方法“1.2.2”在油酸乙酯酯化合成體系中添加不同濃度的四氫嘧啶，反應(yīng)48h，測定油酸乙酯酯化率，結(jié)果見圖4。

圖4 四氫嘧啶添加的濃度對油酸乙酯酯化率的影響

從圖4可知，四氫嘧啶能夠提高脂肪酶催化油酸乙酯合成能力，添加1.5mmol/L的四氫嘧啶添加效果最好，酯化率為61.4%，與沒有添加四氫嘧啶的相比，酯化率提高了24.8%。但四氫嘧啶濃度超過1.9mmol/L，油酸乙酯酯化率降低。

圖4的結(jié)果表明，四氫嘧啶只有在適量范圍內(nèi)才有保護(hù)作用，超過范圍則會抑制酶活性，降低油酸乙酯酯化率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在非水相脂肪酶催化油脂甲醇解時(shí)，補(bǔ)償性溶質(zhì)甘油適量時(shí)會提高酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，但當(dāng)甘油濃度較高時(shí)，會在脂肪酶表面形成親水層，不僅阻礙了疏水性底物向酶活性中心的擴(kuò)散，而且還富集了甲醇，導(dǎo)致甲醇對酶更強(qiáng)的抑制作用［22］。因此，推測添加過量四氫嘧啶對全細(xì)胞脂肪酶的影響，與甘油過量的情況相似，四氫嘧啶達(dá)到較高濃度（大于1.9mmol/L）后，在酶表面形成親水層，富集了乙醇，導(dǎo)致油酸乙酯酯化率降低。

2.4 添加四氫嘧啶對酯化速率的影響

為考察添加四氫嘧啶對油酸乙酯酯化進(jìn)程的影響，按照方法“1.2.2”在體系中添加1.5mmol/L的四氫嘧啶，測定油酸乙酯酯化率。根據(jù)酯化率和反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，按照方法“1.2.3.3”，對油酸酯化量進(jìn)行線性回歸，求出油酸的酯化速率，結(jié)果見圖5。

由圖5所示，無保護(hù)劑的酯化速率是0.287mmol/h（R2=0.99），添加四氫嘧啶的酯化速率是0.396mmol/h（R2=0.9902），提高了38.0%。反應(yīng)48h，酯化率分別是61.4%和49.2%，顯示添加四氫嘧啶提高了油酸乙酯酯化速率。

圖5 四氫嘧啶對酯化速率影響

2.5 四氫嘧啶對全細(xì)胞脂肪酶重復(fù)使用的影響

為考察四氫嘧啶對全細(xì)胞脂肪酶重復(fù)使用時(shí)酶活性的影響，按照方法“1.2.2”在酯化合成體系中添加1.5mmol/L的四氫嘧啶，反應(yīng)48h。測定油酸乙酯的酯化率，每48h為一個反應(yīng)周期。以不添加四氫嘧啶的第一次循環(huán)的油酸乙酯酯化率為100%。在3次重復(fù)使用全細(xì)胞脂肪酶催化酯化合成反應(yīng)中，無添加和添加四氫嘧啶的合成油酸乙酯的相對酯化率見圖6。

圖6 四氫嘧啶對脂肪酶重復(fù)使用的影響

圖6顯示，不添加四氫嘧啶，油酸乙酯酯化率隨重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低，1～3次的相對酯化率分別為100%，41.4%和13.1%。添加四氫嘧啶，油酸乙酯的相對酯化率均顯著提高，但仍隨重復(fù)使用次數(shù)的增加而降低，1～3次分別為124.7%，55.2%和36.6%。與每次循環(huán)中未添加四氫嘧啶比較，相對合成率在第1、2、3次循環(huán)中分別提高了24.7%、33.3%和166.8%，說明添加四氫嘧啶可以延緩酶活性衰減的速度。但循環(huán)3次后，無論是否添加四氫嘧啶，油酸乙酯相對酯化率均較低，只有36.6%（添加四氫嘧啶）和13.1%。

3 結(jié)論

在米曲霉DM-01全細(xì)胞脂肪酶催化油酸和乙醇酯化合成油酸乙酯的無溶劑反應(yīng)體系中，乙醇對脂肪酶有競爭性抑制作用，甚至引起蛋白天然構(gòu)象的破壞，導(dǎo)致脂肪酶的不可逆失活。添加適量補(bǔ)償性溶質(zhì)四氫嘧啶，在全細(xì)胞脂肪酶一次或重復(fù)使用中，均能顯著改善油酸乙酯酯化率。和同質(zhì)量的其他補(bǔ)償性溶質(zhì)比較，四氫嘧啶保護(hù)效果最好。理想的酶穩(wěn)定性保護(hù)劑應(yīng)具備無毒、自身穩(wěn)定、用量小、保護(hù)作用強(qiáng)。四氫嘧啶作為脂肪酶在有機(jī)相穩(wěn)定性保護(hù)劑，在上述性質(zhì)方面優(yōu)勢明顯。添加四氫嘧啶為提高酶法合成油酸乙酯的產(chǎn)率提供了一種新手段。

［1］Bloomer S，Adlercreutz P，Mattiasson B.Facile Synthesis of Fatty Acid Esters in High Yields［J］.Enzyme Microb Technol， 1992，14（7）：546-552.

［2］Kanasawud P，Phutrakul S，Bloomer S，et al.Triglyceride interesterification by lipases 3 Alcoholysis of pure triglycerides［J］.Enzyme Microb Technol，1992，14（12）：959-965.

［3］吳偉，劉一夫，何劍鑌，等.固體超強(qiáng)酸S/TiO2催化合成亞油酸乙酯［J］.精細(xì)化工，2005，22（1）：23-25.

［4］韓慶瑋，李會鵬，楊麗娜，等.含磺酸介孔分子篩SBA-15-SO3H催化合成油酸乙酯［J］.工業(yè)催化，2006，14（3）：36-38.

［5］Hazarika S，Goswami P，Dutta N N，et al.Ethyl oleate synthesis by Porcine pancreatic lipase in organic solvents［J］. Chem Eng J，2002，85（1）：61-68.

［6］Foresti M L，F(xiàn)erreira M L.Solvent-free ethyl oleate synthesis mediated by lipase from Candida antarctica B adsorbed on polypropylene powder［J］.Catal Today，2005，107-108：23-30.

［7］Manjon A，Iborra J L，Arocas A.Short-chain flavour ester synthesis by immobilized lipase in organic media［J］.Biotechnol Lett，1991，13（5）：339-344.

［8］李偉杰，高靜，姜艷軍，等.AOT逆膠束體系脂肪酶催化合成油酸乙酯［J］.過程工程學(xué)報(bào)，2008，8（6）：1173-1178.

［9］Han D，Rhee J S.Biotechnology Letters Batchwise hydrolysis of olive oil by lipase in AOT-isooctane reverse micelles［J］. Biotechnol Lett，1985，7（9）：651-656.

［10］Hoq M M，Yamane T，Shimizu S，et al.Continuous hydrolysis of olive oil by lipase in microporous hydrophobic membrane［J］. J Am Oil Chem Soc，1985，62：1016-1021.

［11］Lee Y K，Choo C L.The kinetics and mechanism of shear inactivation of lipase from Candida cylindracea［J］.Biotechnol Bioeng，1989，33（2）：183-190.

［12］Lippert K，Galinski E A.Enzyme stabilization be ectoinetype compatible solutes：protection against heating，freezing and drying［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1992，37（1）：61-65.

［13］Costa M S，Santos H，Galinski E A.An overview of the role and diversity of compatible solutes in Bacteria and Archaea［J］. Adv Biochem Eng Biotechnol，1998，61：117-158.

［14］Schnoor M，Vo β P，Cullen P，et al.Characterization of the synthetic compatible solute homoectoine as a potent PCR enhancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2004，322（3）：867-872.

［15］Zhang L H，Wang Y，Zhang C Y，et al.Supplementation Effect of ectoine on Thermostability of Phytase［J］.J Biosci Bioeng，2006，102（6）：560-563.

［16］Nagata S，Maekawa Y，Ikeuchi T，et al.Effect of Compatible Solutes on the Respiratory Activity and Growth of Escherichia coli K-12 under NaCl Stress［J］.J Biosci Bioeng，2002，94（5）：384-389.

［17］Zhang L H，Lang Y J，Nagata S.Efficient production of ectoine using ectoine-excreting strain［J］.Extremophiles，2009，13（4）：717-724.

［18］金亮，徐巖，曹光群，華根霉全細(xì)胞脂肪酶催化合成油酸油醇酯［J］.催化學(xué)報(bào)，2006，27（7）：611-614.

［19］顏興和，王棟，徐巖，華根霉脂肪酶有機(jī)相合成酶活的研究［J］.工業(yè)微生物，2005，35（2）：24-28.

［20］Al-Zuhair S，Ling F W，Jun L S.Proposed kinetic mechanism of the production of biodiesel from palm oil using lipase［J］.Process Biochem，2007，42（6）：951-960.

［21］Herskovits T T，Gadegbeku B，Jaillet H.On the Structural Stability and Solvent Denaturation of Proteins I.Denaturation By The Alcohols And Glycols［J］.J Biol Chem，1970，245：2588-2598.

［22］Dossat V，Combes D，Marty A.Continuous enzymatic transesterification of high oleic sunflower oil in a packed bed reactor：influence of the glycerol production［J］.Enzyme Microb Technol，1999，25（3-5）：194-200.

Ectoine improving yield of ethyl oleate catalyzed by lipase

WANG Yue1，2，ZHANG Ling-hua1
（1.Environmental Science and Engineering College，Dalian Maritime University，Dalian 116026，China；2.College of Biotechnology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

To resist the competitive alcohol inhibition on lipase，improving the esterification degree of ethyl oleate by enzymatic synthesis，compatible solutes were added to the solvent-free synthesis system catalyzed by whole-cell lipase from Aspergillus oryzae DM-01.The results indicated that the addition of ectoine led to an increase in the synthesis of ethyl oleate.When 0.1g whole-cell lipase was added in the synthesis system，and the reaction was conducted for 48h，the esterification degree of ethyl oleate reached a maximum of 61.4%in the presence of 1.5mmol/L ectoine，an increase of 24.8%compared with that in the absence of ectoine.The esterification rate increased by 38.0%.Ectoine was added into synthesis systems for whole-cell lipase reuse during three recycling tests.Relative esterification degrees of ethyl oleate increased by 24.7%，33.3%and 166.8%compared with the control without ectoine.The supplementation of ectoine provided a new method for the purpose of improving yield of ethyl oleate catalyzed by enzyme.

ectoine；ethyl oleate；lipase；solvent-free system

TS201.2

A

1002-0306（2010）11-0224-04

2010-04-06

王越（1972-），女，講師，博士研究生，研究方向：非水相酶制劑的應(yīng)用。