高效液相色譜法測定南瓜中β-胡蘿卜素和VE的含量*

田密霞，胡文忠，霍曉雪，王艷穎，姜愛麗，劉程惠，范圣第

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)與資源利用國家民委—教育部重點實驗室，遼寧大連，116600)

高效液相色譜法測定南瓜中β-胡蘿卜素和VE的含量*

田密霞，胡文忠，霍曉雪，王艷穎，姜愛麗，劉程惠，范圣第

(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)與資源利用國家民委—教育部重點實驗室，遼寧大連，116600)

采用高效液相色譜法同時測定新鮮南瓜與經(jīng)冷凍干燥處理后南瓜中β-胡蘿卜素和VE的含量。結(jié)果表明:β-胡蘿卜素濃度在1～6μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，VE的濃度在0.375～2.25μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。南瓜鮮肉中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.78%(RSD=0.12%)和99.75%(RSD=0.3%)，南瓜鮮皮中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.43%(RSD=0.27%)和99.25%(RSD=0.16%)，而在凍干南瓜肉中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.62%(RSD=0.44%)和99.71%(RSD=0.15%)，在凍干南瓜皮中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.11%(RSD=0.13%)和99.75%(RSD=0.07%)。

南瓜，β-胡蘿卜素，VE，高效液相色譜

南瓜營養(yǎng)豐富且全面，含人體全部必需氨基酸、多糖、果膠及礦物質(zhì)，而且南瓜中富含大量的β-胡蘿卜素和豐富的維生素［1－2］。吳增茹［3］等人測定了不同品種南瓜中β-胡蘿卜素的含量，但很少有報道采用HPLC法測定南瓜中VE的含量。本實驗在比較了趙文恩等［4－6］人的方法后，并加以改進(jìn)，采用高效液相色譜(HPLC)法，同時測定市售南瓜肉和南瓜皮中β-胡蘿卜素和VE的含量，節(jié)省了大量的資金和時間，以期為南瓜的日后的進(jìn)一步開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀:日本鳥津，二極管陣列檢測器，柱前加預(yù)柱保護(hù);Labda-250型紫外可見分光光度計:美國PE;電子天平:上海 梅特勒-托利多;微型細(xì)胞破碎儀:USA SONICS VC×130;粉碎機(jī):廣州。

1.2 實驗試劑與材料

1.2.1 試劑

分析純?nèi)燃淄?沈陽市華東試劑廠;色譜純甲醇:德國默克;水為經(jīng)純水裝置進(jìn)行去離子后的雙蒸水，之后進(jìn)行微孔濾膜過濾得到后備用;標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜素:Sigma Fluka;VE:USA SUPELCO。

1.2.2 材料

鮮南瓜采購于大連開發(fā)區(qū)樂購超市，其成熟度、大小、顏色、形狀一致，無病蟲害。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

(1)凍干皮:取鮮南瓜不同部位的表皮，切碎、混勻，稱取約100 g真空冷凍干燥，凍干樣品磨碎，過40目篩，干粉至于樣品瓶中，在干燥器中避光保存。

精確稱取干粉樣品0.2g，加入5mL三氯甲烷，用細(xì)胞破碎器2 s+3 s破碎3 min。用移液槍取下面的清液1mL于10mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。經(jīng)0.45 μm微孔有機(jī)濾膜過濾后，外標(biāo)法進(jìn)行HPLC分析，全部操作均在避光下進(jìn)行。

(2)鮮皮:取南瓜不同部位的表皮，切碎，混勻，稱取1.0 g加入15mL三氯甲烷，勻漿，離心(4℃，6 000 r/min，5 min)，用移液槍取上清液1mL于10mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，外標(biāo)法進(jìn)行HPLC分析，全部操作均在避光下進(jìn)行。

(3)取0.4 g凍干肉(其他步驟及試劑用量同凍干皮)和取3 g鮮肉(其他步驟及試劑用量同鮮皮)分別測定南瓜凍干肉和鮮肉中β-胡蘿卜素和VE的含量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取2.5μgβ-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)用5mL 三氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移到50mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。

取1.9μgVE標(biāo)準(zhǔn)品用10mL三氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中，再用甲醇定容。

1.3.3 最佳檢測波長的確定

使用Labda-250型紫外可見分光光度計在190～500 nm，對南瓜樣品溶液進(jìn)行光譜掃描，選取流動相中β-胡蘿卜素和VE的最大吸收波長作為檢測波長。

1.3.4 色譜分析條件色譜柱

Hypersil ODS C18(4.6 mm ×250 mm i.d.5μm);流動相:甲醇;檢測器:DIODE ARRAY DET-ECTOR;進(jìn)樣法:手動進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20μL。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取等量的β-胡蘿卜素和VE標(biāo)準(zhǔn)樣50、100、150、200、250、300 μ L 于 10mL 棕色容量瓶中，稀釋成梯度濃度(表1)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，在1.3.4色譜條件下檢測，每種濃度重復(fù)進(jìn)樣5次，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，平均峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(分析過程中，未分析標(biāo)準(zhǔn)液于5℃冷藏備用)。

表1 β-胡蘿卜素和VE標(biāo)準(zhǔn)液濃度

1.3.6 樣品的測定

取南瓜樣品按照1.3.1方法制備供試液，按照1.3.4色譜條件進(jìn)行檢測，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，取平均值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中β-胡蘿卜素和VE的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長的選擇

使用Labda-250型紫外可見分光光度計在(190～500)nm波長內(nèi)，在對南瓜對照品溶液進(jìn)行光譜掃描。掃描結(jié)果表明，流動相中南瓜樣品中VE最大吸收波長為 292nm，β-胡蘿卜素最大吸收波長為450nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖1，圖2表明，進(jìn)樣 20μL，南瓜中 β-胡蘿卜素在1～6μg/mL同時VE質(zhì)量在0.375～2.25μg范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度有很好的線性關(guān)系。β-胡蘿卜素回歸方程為y=110.7x-31.684，R2=0.999 5;VE回歸方程為y=110.7x-31.684，R2=0.999 5。圖3，圖4分別為β－胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品和VE標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖，β-胡蘿卜素出峰時間為35.531min，VE出峰時間9.016min。

圖1 β-胡蘿卜素含量測定的工作曲線

圖2 VE含量測定的工作曲線

圖3 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖4 VE標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

2.3 不同提取溶劑的比較

按1.3.1方法V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶90、V(甲醇)∶V(正己烷)=80∶20、三氯甲烷3種溶劑進(jìn)行試驗(平行3組)，結(jié)果表明，三氯甲烷作為提取劑β-胡蘿卜素出峰不明顯，V(甲醇)∶V(正己烷)=80∶20作為提取劑雜峰較多，而甲醇作為提取劑β-胡蘿卜素和VE在出峰時間上不沖突且各自出峰均較明顯，因而最終選擇V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=10∶90作為提取劑。

2.4 樣品的定量分析

2.4.1 β-胡蘿卜素的定量分析

對于β-胡蘿卜素的定量分析，本文采用標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜素的三氯甲烷-醇溶液做外標(biāo)，利用β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中β-胡蘿卜素響應(yīng)峰的相應(yīng)濃度，從而求出樣品中β-胡蘿卜素的含量，結(jié)果如表3所示。從表3中可知，凍干南瓜皮中含有極其豐富的β-胡蘿卜素，達(dá)789.86μg/g，而經(jīng)過冷凍干燥處理的南瓜肉中 β-胡蘿卜素的含量則明顯減少，只有176.73μg/g，這一發(fā)現(xiàn)希望對今后南瓜皮的進(jìn)一步開發(fā)提供一定的依據(jù)。

表3 β-胡蘿卜素的定量分析結(jié)果

2.4.2 VE的定量分析

對于VE的定量分析，本文同對β-胡蘿卜素的定量分析采用了相同的方法。結(jié)果顯示(表4)，鮮南瓜肉中VE的含量最多，達(dá)265.66μg/g，經(jīng)過冷凍干燥處理后的南瓜中，無論是皮還是肉中VE的含量明顯較少，這可能與VE較敏感，易氧化有關(guān)系，與空氣中的氧化劑、紫外線接觸越長時間，氧化越明顯［9］。

表4 VE的定量分析結(jié)果

2.5 方法精密度實驗

從表5的數(shù)據(jù)可以看出每一個RSD值均在允許誤差范圍內(nèi)，實驗精密度良好，實驗數(shù)據(jù)可靠。

2.6 穩(wěn)定性試驗

由于每次進(jìn)樣間隔是1 h，并且所配溶液在低溫、避光保存，溶液性質(zhì)較穩(wěn)定，故可依據(jù)2.5精密度實驗來分析本次實驗的穩(wěn)定性。顯然，由表5可以看出，本次試驗結(jié)果穩(wěn)定性較好，只要注意保存條件(低溫、避光、密封)即可較長時間保持其性質(zhì)不改變。

表5 方法精密度實驗結(jié)果

2.7 加標(biāo)回收率實驗

精確吸取5份已知濃度(β-胡蘿卜素6.318 9μg/mL和VE1.423 2μg/mL)的凍干南瓜皮試液各1mL，分別加入1mL各混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再定容到10mL，按1.3.4色譜條件下進(jìn)行檢測，測定峰面積，計算樣品平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。每個樣品測定5次。

GE 6只以凍干南瓜皮中的β-胡蘿卜素加標(biāo)回收率實驗結(jié)果為例。

表6 凍干南瓜皮β-胡蘿卜素加標(biāo)回收率實驗結(jié)果(n=5) C0=0.63μg/mL

從表6可以看出，在實驗過程中，實驗數(shù)據(jù)精密度和加標(biāo)回收率都比較符合要求，實驗結(jié)果可信。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

通過對南瓜混合標(biāo)準(zhǔn)品(對照組)的光譜掃描圖(圖1)可以看出，南瓜β-胡蘿卜素在450nm處有最大吸收，VE在292nm處有最大吸收，故選擇450nm進(jìn)行計算分析南瓜β-胡蘿卜素含量，選擇292nm處的色譜圖進(jìn)行計算分析南瓜VE含量。

3.2 流動相的選擇

實驗過程中曾用以下種流動相:V(甲醇)∶V(正己烷)=90∶10;V(甲醇)∶V(正己烷)=80∶20;V(甲醇)∶V(水)=80∶10;V(甲醇)∶V(水)=80∶20;純甲醇相。實驗發(fā)現(xiàn)，甲醇與其他溶劑結(jié)合的流動相分離效果都不理想，只有使用純甲醇作為流動相時，β-胡蘿卜素和維生素分離效果好。

3.3 樣品含量的測定

由南瓜β-胡蘿卜素和VE混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖可以看出β-胡蘿卜素的保留時間為35.531min左右，VE的保留時間為9.016min左右。由于β-胡蘿卜素和VE的吸收峰附近極少出現(xiàn)雜峰，故使用外標(biāo)法即可。

4 結(jié)論

本文建立了同時測定南瓜中的β-胡蘿卜素和VE的液相色譜方法。采用甲醇為流動相，能將β-胡蘿卜素和VE很好的分離。南瓜鮮肉中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.78%(RSD=0.12%)和99.75%(RSD=0.3%)，南瓜鮮皮中 β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.43%(RSD=0.27%)和99.25%(RSD=0.16%)，而在凍干南瓜肉中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.62%(RSD=0.44%)和99.71%(RSD=0.15%)，在凍干南瓜皮中β-胡蘿卜素和VE的平均回收率分別為100.11%(RSD=0.13%)和99.75%(RSD=0.07%)。回收率較高。

前處理方法采用加入溶劑三氯甲烷后，用細(xì)胞破碎器2s+3s破碎3min。若樣品的分離度不好再離心后，取清液1mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容。經(jīng)0.45μm微孔有機(jī)濾膜過濾后，外標(biāo)法進(jìn)行HPLC分析，全部操作均在避光下進(jìn)行。該處理方法操作簡單，而且時間短，既有效地減少了處理過程中β-胡蘿卜素和VE的損失，又提高了檢測的準(zhǔn)確性。為以后同時分析同時其他樣品中的β-胡蘿卜素和VE奠定了一定的基礎(chǔ)。

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［2］Gyu-Seong Cho.Chemical composition of the green and ripened pumpkin(Cucurbita moschata Duch.)［J］.Korean Journal of Food Science and Technology，1997，29(4):657－662.

［3］吳增茹，金同銘.用高效液相色譜法測定不同品種南瓜中的 β-胡蘿卜素的含量［J］.華北農(nóng)學(xué)報，1998，13(3):141－144.

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［5］李靜娜，朱其明，肖永華.二極管陣列反向高效液相色譜法測定人血清中VE的含量［M］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008.18(2):259－260.

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［7］曹紅翠.反向高效液相色譜法測定VE中α—E含量［J?.光譜實驗室，2009，26(2):351－353.

Method of HPLC to Determine β-Carotene and VEcontent in Pumpkin

Tian Mi-xia，HuWen-zhong，Huo Xiao-xue，Wang Yan-ying，Jiang Ai-li，Liu Cheng-hui，F(xiàn)an Sheng-di
( Key Laboratory of Biotechnology ＆ Bioresources Utilization，The State Ethnic Affairs Commission -Ministryf Education，College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

Using HPLC method determine the content of β-carotene and VEin fresh pumpkin and pumpkin by freeze-drying treatment in the same time.The results showed that the calibration curve was good linear regression in the range of(1～6)μg/mL for β-carotene and(0.375～2.25)μg/mL for VE.In fresh pumpkin pulp，the average recoveries of β-carotene and VEare 100.78%(RSD=0.12%)and 99.75%(RSD=0.3%).In fresh pumpkin peel，the average recoveries of β-carotene and VEare 100.43%(RSD=0.27%)and 99.25%(RSD=0.16%)respectively.But in pumpkin by freeze-drying pulp the average recoveries of β-carotene and VEare 100.62%(RSD=0.44%)and 99.71%(RSD=0.15%)respectively.In pumpkin by freeze-drying peel，the average recoveries of βcarotene and VEare 100.11%(RSD=0.13%)and 99.75%(RSD=0.07%)respectively.The method is simple，high precision and good repeatability，and provides a reliable scientific basis for pumpkin in determining β-carotene and VE in the same time.

pumpkin，β－carotene，VE，HPLC

碩士，工程師(胡文忠教授為通訊作者)。

*國家自然科學(xué)基金資助(30771508，20972038)資助

2010－05－27，改回日期:2010－09－24