利用Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)市售肉制品中轉(zhuǎn)基因大豆成分*

葉可萍，祝長(zhǎng)青，2，周光宏

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210095)2(江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南京，210001)

利用Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)市售肉制品中轉(zhuǎn)基因大豆成分*

葉可萍1，祝長(zhǎng)青1，2，周光宏1

1(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京，210095)2(江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇南京，210001)

采用優(yōu)化的CTAB法提取肉制品中的大豆DNA，利用Taqman探針Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆成分的內(nèi)外源基因。實(shí)驗(yàn)表明，利用優(yōu)化的CTAB法提取肉制品中大豆基因組DNA，內(nèi)源基因擴(kuò)增良好;19種樣品中有7種檢測(cè)出CaMV 35S啟動(dòng)子基因，5種檢測(cè)出RRS基因。首次揭示轉(zhuǎn)基因大豆成分在中國(guó)市售肉制品中的存在，轉(zhuǎn)基因大豆蛋白已進(jìn)入下游肉制品加工鏈。

轉(zhuǎn)基因大豆，肉制品，實(shí)時(shí)熒光PCR

轉(zhuǎn)基因生物自1994年獲準(zhǔn)推廣以來(lái)［1］，在食品中的應(yīng)用已越來(lái)越廣泛，源于這些生物的各種食品也豐富，并走上人們的餐桌。與傳統(tǒng)食品不同，轉(zhuǎn)基因食品可能對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境存在潛在影響［2－5］。雖然我國(guó)尚未允許種植轉(zhuǎn)基因大豆，但2008年我國(guó)進(jìn)口大豆3 700萬(wàn) t，大部分為轉(zhuǎn)基因大豆(roundup ready soybean，RRS)已進(jìn)入食品消費(fèi)領(lǐng)域。大豆蛋白由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)特性與功能特性，作為肉品工業(yè)必不可少的成分，占據(jù)重要角色，成為最廣泛應(yīng)用的植物蛋白。隨著國(guó)產(chǎn)大豆的緊缺，轉(zhuǎn)基因大豆越來(lái)越多地占據(jù)我國(guó)市場(chǎng)，由于美國(guó)大豆大部分是抗除草劑草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，轉(zhuǎn)基因里的成分很有可能進(jìn)入到肉制品的加工鏈中。熒光定量PCR是新近出現(xiàn)的一種定量PCR檢測(cè)方法，主要有非特異性染料結(jié)合和熒光探針標(biāo)記2種。目前應(yīng)用較多的是Taqman探針?lè)?，它是在常?guī)PCR反應(yīng)體系中加入一個(gè)特異性的Taqman熒光標(biāo)記探針，通過(guò)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程［6］。由于Taqman探針Real-time PCR的特異性強(qiáng)、靈敏度高，因此近年來(lái)常被用于檢測(cè)食品中轉(zhuǎn)基因生物的基因成分。

目前，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆食品的技術(shù)路線通常為:首先對(duì)樣品進(jìn)行大豆內(nèi)源基因檢測(cè)并判斷DNA提取效果;其次對(duì)樣品進(jìn)行篩選檢測(cè)并判定其結(jié)果為陽(yáng)性或陰性;最后對(duì)篩檢陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)驗(yàn)證并做出肯定或否定的判定［7］。Fábio 等［8］對(duì)巴西市場(chǎng)上含大豆蛋白質(zhì)的肉食品添加劑的研究表明，32個(gè)食品添加劑樣本中25個(gè)樣本檢測(cè)到164 bp Lectin基因片段，15個(gè)樣本中檢測(cè)到抗草甘膦大豆的特異基因169 bp片段;在8種肉食品中檢測(cè)到Lectin基因，3種檢測(cè)到抗草甘膦大豆特異基因。Taski-Ajdukovic等［9］在塞爾維亞市場(chǎng)上銷售的51個(gè)肉制品中，利用Realtime PCR法發(fā)現(xiàn)其中12種可檢測(cè)到35S啟動(dòng)子的195 bp片段。Paola等［10］在檢測(cè)大豆產(chǎn)品及可能含有大豆成分的加工品中發(fā)現(xiàn)6種香腸產(chǎn)品中有2種存在RR大豆DNA成分。Ralf等［11］抽查的100個(gè)樣品中21%含有轉(zhuǎn)基因成分，其中3種大豆分離蛋白中就有一種檢測(cè)到含外源基因。Gabriella等［12］調(diào)查匈牙利市場(chǎng)21種肉制品，均檢測(cè)到Lectin基因，同時(shí)定量檢測(cè)外源基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，5種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量＞5%，3種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量在0.9%～5%，4種樣品轉(zhuǎn)基因成分含量＜0.1%。國(guó)外轉(zhuǎn)基因的大豆蛋白已作為食品成分在加工肉制品中商業(yè)化應(yīng)用，對(duì)肉制品的安全性提出了新的挑戰(zhàn)。

隨著國(guó)產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因大豆的緊缺，我國(guó)肉制品企業(yè)有可能應(yīng)用含轉(zhuǎn)基因成分的大豆蛋白，但由于肉制品中大豆蛋白含量較少，且肉制品與大豆產(chǎn)品不同，屬于大豆下游食品鏈產(chǎn)品，因此有必要對(duì)市售肉制品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)。因此，調(diào)研市售肉制品中轉(zhuǎn)基因成分的存在狀況，可提供轉(zhuǎn)基因成分在我國(guó)肉制品鏈中加工及流通環(huán)節(jié)的信息，了解其在我國(guó)肉制品市場(chǎng)的分布現(xiàn)狀，為下游食品中轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識(shí)與追溯打下基礎(chǔ)，確保“從農(nóng)田到餐桌”全程將轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品分開(kāi)和標(biāo)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

根據(jù)大豆蛋白在肉制品配料配方中的作用，購(gòu)買6個(gè)企業(yè)的19種市售低溫肉制品(如香腸、火腿等)，于4℃保存，直至DNA提取。

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的Premix預(yù)混液:TaKaRa DRR039A;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):經(jīng)過(guò)確認(rèn)的轉(zhuǎn)基因大豆提取核酸后經(jīng)驗(yàn)證，稀釋到合適濃度用于檢測(cè);引物和探針參照ISO 21570:2005和 GB19495.4－2004，由 TaKa-Ra公司合成，序列見(jiàn)表3;其他試劑均為分析純。

表1 本研究所用引物及探針

1.2 主要儀器與耗材

Roche LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增儀，瑞典羅氏公司;Nanodrop 1000 Thermal核酸蛋白測(cè)定儀，美國(guó)熱電公司;Avanti J-E落地式高效冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī)，AllegraTM64R Centrifuge，美國(guó)Beckman Coulter公司;96孔熒光PCR反應(yīng)板;200、20、10μL濾芯槍頭;其他常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

將GB/T 19495.3－2004中CTAB法進(jìn)行改良優(yōu)化，提取樣品核酸。流程為:稱取5 g樣品，剪碎放于50mL離心管中，加入12.5mL CTAB提取緩沖液和39μL蛋白酶K(20mg/mL)，顛倒混勻后于65℃孵育混勻機(jī)中30 min;20 000 g離心10 min，提取上清液1mL于1.5mL離心管，加入2μL RNase A酶(100mg/mL)，60℃孵育15 min;18 000g離心3 min，取上清液700μL于1.5mL離心管;加入與上清液等體積的三氯甲烷，顛倒混勻后，20 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液600μL于2mL離心管;加入2×體積CTAB沉淀液，顛倒混勻后，室溫靜置12 h;20 000 g離心10 min，棄去上清液，向沉淀中加入400μL NaCl溶液，使沉淀溶解;在溶解液中加入等體積三氯甲烷，顛倒混勻后，20 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層水相至1.5mL離心管中;加入0.6倍體積經(jīng)4℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后，于4℃下靜置30 min;4℃下20 000 g離心10 min，小心棄去上清液;加入750μL經(jīng)4℃預(yù)冷的75%乙醇，傾斜離心管，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)圈后，4℃下20 000 g離心10 min，小心棄去上清液;用經(jīng)4℃預(yù)冷的75%乙醇按相同方法重復(fù)洗1次。室溫下后放置揮干液體;加 50μL AE緩沖液(60℃預(yù)熱)溶解DNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA濃度與純度測(cè)定

以AE緩沖液為空白調(diào)0，取2μL樣品，滴于Nanodrop核酸蛋白測(cè)定儀的鏡片上，對(duì)DNA濃度與純度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR

按表2配制實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)程序:第1階段預(yù)變性95℃/20 s;第2階段95℃/10 s、60℃/30 s，循環(huán)數(shù)55;第3階段40℃/20 s冷卻儀器。在第2階段的退火延伸時(shí)段收集熒光值，PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照以轉(zhuǎn)基因大豆的DNA溶液為模板;試劑空白對(duì)照(以水代替DNA模板)。每個(gè)樣品作2個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉制品中轉(zhuǎn)基因大豆成分核酸提取效果

肉制品是利用畜禽肉為主要原料，經(jīng)調(diào)味制作的熟肉制成品或半成品［13］，它是一種混合物質(zhì)，包含瘦肉、肥肉、添加劑、調(diào)味料等。利用優(yōu)化的CTAB法提取的核酸，經(jīng)Nanodrop測(cè)定得到，樣品DNA濃度均大于50 ng/μL，A260/A280均在 1.8～2.0，提取的DNA均適合于PCR的擴(kuò)增。

表2 Real-time PCR反應(yīng)體系

2.2 大豆內(nèi)源Lectin基因檢測(cè)

提取到一定數(shù)量的大豆基因組DNA是進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分PCR擴(kuò)增的前提條件，對(duì)被檢測(cè)樣品內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是判斷食品組分和DNA提取質(zhì)量的有效方法。大豆基因植物凝集素基因(Lectin)在大豆細(xì)胞中的表達(dá)量或在其基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其數(shù)量多少可作為大豆基因組大小的參照［14－17］。通過(guò)對(duì) Lectin基因的擴(kuò)增，可以判斷所提取大豆DNA是否適合于PCR擴(kuò)增，避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。從圖1可看到，試劑空白對(duì)照的熒光曲線平直，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表明反應(yīng)體系工作正常。樣品同樣出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表明肉制品中大豆蛋白的基因組DNA可利用優(yōu)化的CTAB法及Real－time PCR得到檢測(cè)。

圖1 19種樣品Lectin內(nèi)源基因擴(kuò)增曲線

2.3 CaMV 35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)

篩選檢測(cè)主要是以轉(zhuǎn)基因植物的通用元件和標(biāo)記基因作為特異性擴(kuò)增片段［18］。由于相同的通用元件和標(biāo)記基因常被用于多種轉(zhuǎn)基因植物的研究與生產(chǎn)，從而大大降低了篩選PCR檢測(cè)的特異性，只能用于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)的初步篩選。檢測(cè)到這些通用元件只預(yù)示著檢測(cè)樣品中存在有轉(zhuǎn)基因成分。

CaMV 35S啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)基因大豆使用的啟動(dòng)子，CaMV 35S啟動(dòng)子基因存在于外源插入基因表達(dá)框架中，非轉(zhuǎn)基因植物中不存在該基因。因此，對(duì)CaMV 35S啟動(dòng)子進(jìn)行擴(kuò)增可以對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行初篩，確定肉制品中是否存在轉(zhuǎn)基因成分。由圖2可看出，反應(yīng)體系工作正常，部分樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，即檢測(cè)的19種肉制品中有7種擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子特異性片段。由結(jié)果可得，市售肉制品可能已受轉(zhuǎn)基因植物成分污染，對(duì)樣品進(jìn)行初步的篩選。

圖2 19種樣品CaMV 35S啟動(dòng)子基因擴(kuò)增曲線

2.4 RRS基因檢測(cè)

構(gòu)建特異性檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)外源插入載體中兩個(gè)元件的連接區(qū)DNA序列的擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)的，具有相對(duì)較高的特異性，能確證抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆成分的存在。本研究選取35S與CTP的連接區(qū)RRS基因進(jìn)行擴(kuò)增確證。由圖3可看出，反應(yīng)體系工作正常，部分樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，即檢測(cè)的19種肉制品中有5種擴(kuò)增出RRS特異性片段。

3 討論

對(duì)市場(chǎng)上銷售的肉制品調(diào)查發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上許多肉制品的配料表中均含有大豆蛋白，說(shuō)明許多肉品加工企業(yè)添加一定量的大豆蛋白等增稠劑來(lái)提高其出品率。本試驗(yàn)根據(jù)大豆蛋白在肉制品配料表中的位置，購(gòu)買6個(gè)企業(yè)的19種市售低溫肉制品(如香腸、火腿等)，保證樣品中含有足夠檢的大豆蛋白用于檢測(cè)。

對(duì)于肉制品中RRS成分的檢測(cè)，需要高效率高質(zhì)量的核酸提取方法。CTAB法主要通過(guò)CTAB分離緩沖液將DNA溶解出來(lái)，再經(jīng)氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后得到DNA，適用于混合物的DNA提取。由于肉制品中物質(zhì)比較復(fù)雜，且大豆蛋白含量較少(一般為2%～6%)［19］，因此有必要采取一些措施如提高取樣量、延長(zhǎng)DNA沉降時(shí)間等來(lái)提高DNA提取效率。由結(jié)果可看出本試驗(yàn)優(yōu)化的CTAB法適用于肉制品中大豆組織DNA的提取。同時(shí)，由于大豆蛋白已為大豆的加工品，在進(jìn)入下游食品鏈時(shí)又經(jīng)過(guò)肉制品的相關(guān)工藝過(guò)程，DNA可能發(fā)生不同程度的降解，選擇較短的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增是進(jìn)行成功檢測(cè)的關(guān)鍵［20］。有研究發(fā)現(xiàn)，靶標(biāo)序列在100 bp時(shí)可以抵御惡劣的加工工藝［21］。因此本試驗(yàn)選取的擴(kuò)增片段均小于100 bp，分別為L(zhǎng)ectin(81 bp)、CaMV 35S(74 bp)和RRS(83 bp)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)選取南京市場(chǎng)上6個(gè)企業(yè)的19種市售肉制品，7種樣品擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子特異性片段，5種樣品擴(kuò)增出RRS特異性片段，這5種產(chǎn)品中含轉(zhuǎn)基因大豆成分，僅擴(kuò)增出CaMV 35S啟動(dòng)子的產(chǎn)品可能含有轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí)這些檢測(cè)出的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性品并非來(lái)自同一個(gè)企業(yè)，說(shuō)明國(guó)內(nèi)有些肉品企業(yè)應(yīng)用的大豆蛋白已含有轉(zhuǎn)基因成分。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在南京市場(chǎng)選取的19種肉制品中有5種產(chǎn)品檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因成分，說(shuō)明我國(guó)市場(chǎng)中流通的一些大豆蛋白中含轉(zhuǎn)基因，我國(guó)肉制品企業(yè)應(yīng)用了這些含轉(zhuǎn)基因成分的大豆蛋白，使其進(jìn)入下游肉制品加工鏈，這對(duì)轉(zhuǎn)基因的標(biāo)識(shí)與追溯提出了新的要求。同時(shí)抗除草劑草甘膦大豆(RRS)的大豆蛋白已作為食品成分在加工肉制品中商業(yè)化應(yīng)用，也對(duì)肉制品的安全性提出了新的挑戰(zhàn)。

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Detection of Genetically Modified Soybean Ingredients in Meat Products by Taqman Real-time PCR

Ye Ke-ping1，Zhu Chang-qing1，2，Zhou Guang-hong1
1(Key Laboratory of Food Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control，Ministry of education，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)2(Jiangsu Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China)

This article used the cety-ltrimehyl ammonium bromide(CTAB)method with some modifications to extract DNA，endogenous and exogenous genes of genetically modified soybeans were detected using Taqman Realtime PCR.Nineteen samples of meat products containing soy proteins were tested for the presence of soybean amplifiable DNA using the CTAB extraction methods with modifications，all the samples gave a positive signal for the lectin gene，7 samples returned a positive signal for CaMV 35S promoter detection，and 5 samples for specific RR detection confirming the presence of genetically modified soybean.These results demonstrate for the first time the presence of RR soybean in meat products sold commercially in China，and genetically modified soybean proteins have got into the downstream chains of meat products.

genetically modified soybean，meat products，Real-time PCR

碩士研究生(周光宏教授為通訊作者)。

*農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)課題:食品鏈中轉(zhuǎn)基因生物的溯源與污染評(píng)估模型的研究(2009ZX08012－014B)

2010－06－19，改回日期:2010－09－27